吳凡，金培印，王學(xué)惠

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、腦梗死及外周血管病等心腦血管疾病發(fā)病的主要原因之一，已成為引起心腦血管疾病患者致死和致殘的重要原因[1]。目前，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制還未被完全闡明，但研究指出高血壓、高血糖、吸煙遺傳等因素是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素[2]，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其引起的級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)是引起動(dòng)脈粥樣硬化病發(fā)生的重要步驟[3]。同型半胱氨酸（Hcy）是目前研究發(fā)現(xiàn)的通過(guò)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要物質(zhì)之一，其不僅被發(fā)現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、腦卒中等心腦血管疾病患者的血液含量增高，還被認(rèn)為是心腦血管疾病發(fā)病的危險(xiǎn)因素[4,5]。之前的研究表明[6,7]，同型半胱氨酸在體外可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但其引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還是清楚。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是一種組蛋白去乙?；?，已經(jīng)被證實(shí)參與調(diào)控哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等等生物學(xué)功能[8]。Matteo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1通過(guò)抑制重建氧化還原平衡和恢復(fù)線粒體功能而抑制氧化應(yīng)急引起的牛皮癬患者成纖維細(xì)胞的凋亡。此外，SIRT1還被發(fā)現(xiàn)可減輕缺氧引起的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10]和影響高糖環(huán)境下血管內(nèi)皮細(xì)胞活力[11]。因此，本研究通過(guò)建立Hcy誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞體外損傷模型和過(guò)表達(dá)SIRT1內(nèi)皮細(xì)胞系以研究Hcy處理對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1表達(dá)的影響，并探討上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1表達(dá)對(duì)Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與過(guò)表達(dá)SIRT1HMEC-1細(xì)胞培養(yǎng)在添加有10%胎牛血清（10100-147，thermofisher，美國(guó)）的DMEM培養(yǎng)基（12491-15，thermo fisher，美國(guó)）中，培養(yǎng)條件為37℃和5%CO2。過(guò)表達(dá)SIRT1的慢病毒（pcDNASIRT1）購(gòu)買自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，并以空載質(zhì)粒（pcDNA3.1）作為對(duì)照，慢病毒感染HMEC-1細(xì)胞72 h后，通過(guò)qPCR和免疫印記法檢測(cè)SIRT1表達(dá)以驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效率。

1.2 CCK8試劑盒和檢測(cè)細(xì)胞活性將0.2×105個(gè)HMEC-1細(xì)胞接種在96孔板的每個(gè)孔中，培養(yǎng)12 h后，向培養(yǎng)液中加入不同濃度的Hcy（0、1、2和4 mmol/L）處理24 h，去除細(xì)胞培養(yǎng)基后，將10 μl CCK8溶液（C0009，Beyotime Scientific，中國(guó)）和100 μl細(xì)胞培養(yǎng)基中加入到細(xì)胞中，在37℃和5%CO2下培養(yǎng)1 h后測(cè)定OD450。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡將1.0×106個(gè)HMEC-1細(xì)胞接種在6孔板的每個(gè)孔中，培養(yǎng)12 h后，然后向培養(yǎng)液中加入不同濃度的Hcy（0、1、2和4 mmol/L）處理24 h，收集HMEC-1細(xì)胞，根據(jù)Annexin V-FITC/PI（40302ES20，上海翊圣生物科技有限公司，中國(guó)）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒所述檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR細(xì)胞經(jīng)不同方式處理后，被收集后通過(guò)加入適量的RNAiso以提取RNA。根據(jù)提取RNA的含量加入ddH2O溶解RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）測(cè)定RNA濃度。然后用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR參數(shù)設(shè)定：37℃/60 min，85℃/5 s。RT-qPCR：根據(jù)GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書制備20 μl RT-qPCR系統(tǒng)，使用ABI 7500熒光定量PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。PCR引物如下：

SIRT1-F: 5'-TCGCAACTATACCCAGAACATA GACA-3'；

SIRT1-R: 5'-CTGTTGCAAAGGAACCATGACA-3'。β-actin引物參照之前的研究。

1.5 蛋白免疫印跡法細(xì)胞經(jīng)不同方式處理后，被收集后通過(guò)RIPA裂解液（R0010，Solarbio，中國(guó)）從細(xì)胞中提取總蛋白。通過(guò)10%SDSPAGE分離50 μg總蛋白。將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。用PBS洗滌膜3遍后，將膜與SIRT1抗體（ab189494，abcam，英國(guó)）在4℃孵育過(guò)夜。然后在室溫下添加二抗孵育2 h。用PBS洗滌3次后，加入ECL溶液（WBKLS0100，北京新晶科生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hcy誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡將不同濃度的Hcy與血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24 h，通過(guò)CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性后發(fā)現(xiàn)，與0 mmol/L Hcy組相比，經(jīng)1、2和4 mmol/L Hcy處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且Hcy濃度越高，血管內(nèi)皮細(xì)胞活性越低（如圖1A所示）；通過(guò)流式細(xì)胞儀分析不同組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，與0 mmol/L Hcy組相比，經(jīng)1、2和4 mmol/L Hcy處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且Hcy濃度越高，細(xì)胞凋亡率越高，具體如圖1B和1C所示。

圖1 同型半胱氨酸以劑量依賴形式誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

2.2 Hcy抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1的表達(dá)將不同濃度的Hcy與血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)24 h，經(jīng)qPCR檢測(cè)SIRT1 mRNA表達(dá)和經(jīng)免疫印跡法檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與0 mmol/L Hcy處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，SIRT1在經(jīng)1、2和4 mmol/L Hcy處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且Hcy濃度越高，SIRT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)越低（圖2）。

圖2 同型半胱氨酸以劑量依賴形式抑制SIRT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)

2.3 上調(diào)SIRT1減低Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡通過(guò)向血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pcDNA-SIRT1以上調(diào)SIRT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)向血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒（pcDNA3.1）作為對(duì)照。經(jīng)qPCR檢測(cè)SIRT1 mRNA表達(dá)和經(jīng)免疫印跡法檢測(cè)SIRT1蛋白表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，向血管內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)入pcDNA-SIRT1成功顯著上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3A和圖3B。將表達(dá)SIRT1不同的血管內(nèi)皮細(xì)胞與2 mmol/L同型半胱氨酸培養(yǎng)24 h，通過(guò)CCK8試劑盒測(cè)定血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：與pcDNA3.1組相比，pcDNA-SIRT1組血管內(nèi)皮細(xì)胞活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖3C所示；并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：與pcDNA3.1組相比，pcDNA-SIRT1組血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見3D和3E。

圖3 過(guò)表達(dá)SIRT1抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

2.4 上調(diào)SIRT1對(duì)凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響將表達(dá)SIRT1不同的血管內(nèi)皮細(xì)胞與2 mmol/L Hcy酸培養(yǎng)24 h，通過(guò)qPCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示：與pcDNA3.1組相比，pcDNASIRT1組血管內(nèi)皮細(xì)胞中Bcl2表達(dá)顯著降低，Bax和Cyt C表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)SIRT1對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響

3 討論

Hcy是一種含硫氨基酸，為蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的重要中間產(chǎn)物。正常生理?xiàng)l件下，血液中的Hcy在體內(nèi)被分解代謝，因此Hcy在體內(nèi)維持在較低濃度。當(dāng)機(jī)體病變時(shí)，Hcy因分解代謝受阻堆積使得濃度升高。研究表明高Hcy會(huì)大幅增加冠心病、外周血管疾病及腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而其分子機(jī)制可能與Hcy引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)[6,7]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Hcy處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性降低、凋亡增加，且Hcy濃度越高，血管內(nèi)皮細(xì)胞活性越低，凋亡率越高，即以濃度依賴形式在體外誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。與宓寶斌等[12]研究結(jié)果一致，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)0.5、1.0和1.5 mmol/L Hcy處理的ECV-304內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率逐漸升高，表明Hcy引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與濃度有關(guān)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Hcy以劑量依賴形式抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)，與之前研究結(jié)果類似。Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷通過(guò)增加SIRT1蛋白的表達(dá)而氧化的低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。Marampon等[14]研究表明，維生素D，一種在心腦血管疾病患者中常表現(xiàn)為缺乏的維生素，可通過(guò)上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)而減輕輻射引起的內(nèi)皮細(xì)胞衰老和凋亡。SIRT1是sirtuin蛋白家族的成員之一，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白去乙?；福洳粌H通過(guò)去乙?；M蛋白而維持染色質(zhì)和基因組的穩(wěn)定，還可通過(guò)其去乙酰化非組蛋白的功能而參與細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控[8]，且之前研究發(fā)現(xiàn)SIRT1參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果提示，SIRT1參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，且上調(diào)其表達(dá)可減輕外界因素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。結(jié)合本次研究，Hcy可能通過(guò)下調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

為了研究SIRT1表達(dá)對(duì)Hcy誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，我們建立了過(guò)表達(dá)SIRT1內(nèi)皮細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SIRT1過(guò)表達(dá)可以顯著降低Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。此外，我們研究還發(fā)現(xiàn)，SIRT1過(guò)表達(dá)可顯著抑制促凋亡基因Bcl2的表達(dá)和促進(jìn)抗凋亡基因Bax、Cyt C的表達(dá)。根據(jù)起始caspase的不同，可將哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凋亡分為三種基本途徑[15,16]：一是外在途徑，即由細(xì)胞表面的死亡受體如fas和腫瘤壞死因子受體家族引發(fā)；另一種稱為內(nèi)在途徑或線粒體途徑，由許多應(yīng)激條件（如缺氧、低糖）、化學(xué)治療試劑和藥物所起始；第三種途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致caspase-12的活化，從而導(dǎo)致凋亡。此前研究已經(jīng)證實(shí)，Hcy主要通過(guò)線粒體凋亡途徑引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，即Hcy抑制內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞Bax的表達(dá)而引起B(yǎng)ax/Bcl2比例失衡，引起細(xì)胞線粒體膜電位改變及線粒體細(xì)胞色素釋放，激活Caspase家族蛋白，最終導(dǎo)致內(nèi)皮凋亡的發(fā)生[17]。因此，上調(diào)SIRT1是通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑而抑制Hcy引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，Hcy可能通過(guò)抑制SIRT1的表達(dá)而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而上調(diào)SIRT1表達(dá)可減少Hcy誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，SIRT1是開發(fā)減少Hcy引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的潛在靶點(diǎn)。