劉慧意， 饒芳， 葉興東， 金書羽，2， 付路， 鄧春玉，楊慧， 鄺素娟， 吳書林， 薛玉梅△

機(jī)械力敏感離子通道Piezo1參與高血壓誘導(dǎo)心房纖維化的機(jī)制研究*

劉慧意1， 饒芳1， 葉興東1， 金書羽1，2， 付路1， 鄧春玉1，楊慧1， 鄺素娟1， 吳書林1， 薛玉梅1△

（1廣東省心血管病研究所心內(nèi)科，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東 廣州 510080；2南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515）

利用小鼠心房成纖維細(xì)胞探討機(jī)械敏感離子通道Piezo1在調(diào)控高血壓所致心房纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致房顫中的作用及可能機(jī)制。采用酶消化法分離培養(yǎng)6～8周齡雄性C57BL/6小鼠的原代心房成纖維細(xì)胞，并采用課題組自制的加壓裝置（專利號(hào)201420109263.1）建立高血壓模型，Western blot比較不同靜水壓（0、20和40 mmHg）干預(yù)下細(xì)胞Piezo1、Src/p-Src及纖維化指標(biāo)I/III型膠原蛋白α1鏈（Col1A1/3A1）和基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）蛋白表達(dá)水平。高靜水壓（40 mmHg）干預(yù)下的心房成纖維細(xì)胞，分別給予不同濃度（1、3和 10 μmol/L）的Piezo1抑制劑GsMTx4，或轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒降低Piezo1的表達(dá)，以及不同濃度（5和10 μmol/L）的Src抑制劑PP1，觀察細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化相關(guān)因子蛋白水平的變化。常壓下給予不同濃度（1、3和10 μmol/L）的Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1，觀察心房成纖維細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化相關(guān)因子蛋白水平的變化。隨著壓力升高，小鼠心房成纖維細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化指標(biāo)Col1A1/3A1和MMP-2/9蛋白表達(dá)水平顯著升高（<0.05）；GsMTx4/siRNA或PP1處理后，可使高靜水壓導(dǎo)致的Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子水平下降（<0.05）。而細(xì)胞給予Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1可模擬出高靜水壓干預(yù)的結(jié)果（<0.05）。在小鼠心房成纖維細(xì)胞中，機(jī)械敏感通道蛋白Piezo1可能通過(guò)調(diào)控Src/p-Src參與高血壓所致的心房纖維化。

Piezo1蛋白；高血壓；心房成纖維細(xì)胞；心房顫動(dòng)

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床中常見(jiàn)的心律失常之一，我國(guó)總體發(fā)病率高達(dá)1.14%［1］。房顫危害嚴(yán)重，可引起腦卒中、充血性心力衰竭，甚至危及生命。高血壓是心房顫動(dòng)最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素。高血壓合并房顫時(shí)可顯著增加不良事件風(fēng)險(xiǎn)，包括腦卒中、心血管事件、全因死亡風(fēng)險(xiǎn)等［2］。然而，高血壓促進(jìn)房顫形成機(jī)制仍不明確。

長(zhǎng)期高血壓狀態(tài)使左心室后負(fù)荷增加，左心房長(zhǎng)期被動(dòng)牽拉導(dǎo)致其內(nèi)徑增大、順應(yīng)性增加及收縮力下降，且這種生物力學(xué)牽拉能直接誘導(dǎo)心房纖維化的產(chǎn)生以及引起離子通道電流改變，成為房顫發(fā)生的基礎(chǔ)［3］。但目前關(guān)于高血壓導(dǎo)致心房纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致房顫的具體分子機(jī)制仍不明確。

新型離子通道Piezo1是近年來(lái)鑒定出的哺乳動(dòng)物的機(jī)械門控離子通道，主要在暴露于流體壓力的非感覺(jué)組織中表達(dá)，廣泛參與血管發(fā)育、動(dòng)脈重塑和血壓調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和紅細(xì)胞體積調(diào)節(jié)等病理生理過(guò)程［4-5］。研究表明，Piezo1在小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)并可被拉伸力激活，通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中Ca2+濃度，升高交聯(lián)酶活性，調(diào)節(jié)高血壓時(shí)小動(dòng)脈的直徑和壁厚，影響小動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)重塑［6］。此外，Piezo1在心肌梗死心衰大鼠心臟中表達(dá)增加，并可被血管緊張素受體阻滯劑氯沙坦所抑制；體外予以血管緊張素II刺激新生大鼠心室肌細(xì)胞可通過(guò)AT1受體依賴性途徑上調(diào)Piezo1表達(dá)［7］。但高血壓導(dǎo)致心房壓力增加時(shí)，Piezo1是否參與心房纖維化尚未見(jiàn)報(bào)道。

此外，編碼膜相關(guān)的酪氨酸激酶，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。近年來(lái)的研究表明，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型和氯化鈷處理的L929細(xì)胞（小鼠成纖維細(xì)胞）中，新型肽類Src抑制劑KX-01顯著抑制p-Src，降低α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）和膠原的表達(dá)［8］。我們的前期研究提示Src參與了高靜水壓下心房肌細(xì)胞的Ca，L以及L型鈣通道α1c亞單位（L-type calcium channel α1C，Cav1.2）的表達(dá)，促進(jìn)房顫發(fā)生［9］。然而，在高血壓患者中，心房組織中的Src是否通過(guò)調(diào)節(jié)心房纖維化參與房顫的發(fā)病，心房組織中的Piezo1是否通過(guò)Src調(diào)節(jié)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)尚不清楚。因此，本研究中，我們擬證實(shí)小鼠心房成纖維細(xì)胞膜上的新型離子通道Piezo1，在機(jī)械應(yīng)力的作用下激活，激活Src激酶，促進(jìn)心房纖維化，參與房顫的發(fā)生和維持。

材料和方法

1　動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠由廣東省廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，20～25 g，共30只，許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0034。SPF級(jí)Wistar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat， SHR）各3只，30～35周齡，購(gòu)自北京維通利華，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXKD（京）2016-0006。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（No. 201904010451）。

2　主要試劑

Opti-MEM培養(yǎng)液、特級(jí)澳洲胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）；成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Lonza）；蛋白Marker（Fermentas）；4×蛋白上樣緩沖液（Bio-Rad）；RIPA裂解液（強(qiáng)）和BCA試劑盒（Beyotime）；抗Piezo1抗體（Alomone）；抗I型膠原蛋白α1鏈（collagen type I α1 chain， Col1A1）抗體、抗III型膠原蛋白α1鏈（collagen type III α1 chain， Col3A1）抗體和抗基質(zhì)金屬蛋白酶2/9（matrix metalloproteinase-2/9， MMP-2/9）抗體（Abcam）；抗GAPDH抗體、抗Src抗體和抗p-Src抗體（Cell Signaling Technology）；GsMTx4和Yoda1（MedChemExpress）；PP1（Selleck）；siRNA和陰性對(duì)照（RiboBio）；Lipofactamine 3000脂質(zhì)體（Thermo Fisher Scientific）。

3　主要方法

3.1原代心房成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染6～8周齡的雄性C57BL/6J小鼠，頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒小鼠，高壓滅菌后的眼科剪剪開胸腔，取出心臟，剪下左右心耳及心房組織，洗清殘血，剪碎組織至1 mm×1 mm×1 mm大小。無(wú)菌巴氏管吸取5 mL 0.25%胰酶至離心管中，輕輕吹打消化約3 min，靜置1 min，將上清轉(zhuǎn)移至含胎牛血清的終止液中，終止消化，如此反復(fù)至組織塊基本消失。將消化所得的混懸液經(jīng)100目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后，410×離心15 min，棄上清，用5 mL 10%培養(yǎng)液重懸后接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h后換液。第2～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋5 μg質(zhì)粒，輕輕混勻；250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋6 μL Lipofectamine 3000試劑，分別震蕩混勻。然后將含有質(zhì)粒和脂質(zhì)體的稀釋液充分混勻，室溫孵育15 min后，加入細(xì)胞中，6 h后換液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

3.2Western blot實(shí)驗(yàn)細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，吸去培養(yǎng)液，PBS洗3次后加入100 μL含蛋白酶抑制劑RIPA裂解液（強(qiáng)），冰上裂解20 min后收集細(xì)胞。4 ℃、13 200×離心15 min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在20 μg蛋白質(zhì)樣品中加入4×蛋白上樣緩沖液，55 ℃變性10 min。配制10% SDS-PAGE分離蛋白樣品，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST配制5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h。TBST洗3次，每次5 min。對(duì)應(yīng)的Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min。Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。配制ECL發(fā)光液，PVDF膜蛋白面朝上均勻滴加ECL發(fā)光液，放入化學(xué)發(fā)光成像儀中自動(dòng)曝光。

3.3細(xì)胞免疫熒光染色待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min后棄去，PBS浸洗3次，每次5 min。0.5% Triton X-100通透15 min后棄去，PBS洗3次，每次5 min。4%牛血清白蛋白封閉30 min，去除封閉液直接滴加稀釋好的Ⅰ抗放入裝有濕棉球的避光盒，4 ℃孵育過(guò)夜。第2天取出共聚焦皿，PBS浸洗3次，每次5 min。加入相應(yīng)的熒光Ⅱ抗室溫孵育1 h。PBS浸洗3次，每次5 min。避光滴加DAPI封片劑后在共聚焦顯微鏡下觀察。

3.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力將小鼠心房成纖維細(xì)胞培養(yǎng)并傳至p2代，分別轉(zhuǎn)染negative control RNA及siRNA，6 h后換液并消化，將細(xì)胞定量至2×107L-1，接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)副孔，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，空白組加入100 μL 10%胎牛血清培養(yǎng)液，放入高靜水壓培養(yǎng)箱培育。0、12、24、48和72 h時(shí)取出細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8工作液，孵育2 h后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（）。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0分析處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較用檢驗(yàn)；多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)或SNK-檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　原代心房成纖維細(xì)胞的分離與鑒定

將原代分離培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞傳代至第2代，接種于共聚焦皿上，免疫熒光法檢測(cè)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白α-SMA。結(jié)果顯示，第2代細(xì)胞中α-SMA染色呈陽(yáng)性（圖1），說(shuō)明從小鼠心房組織分離的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。

Figure 1.Immunofluorescence image of primary mouse atrial fibroblasts. Blue is the nucleus， and red is α-SMA. The scale bar=100 μm.

2　Wistar大鼠及SHR左心房組織中Piezo1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

基線資料顯示，SHR組收縮壓、平均血壓、舒張壓及心率均顯著高于Wistar組（<0.05），見(jiàn)表1。

表1　Wistar大鼠和SHR的血壓和心率

SBP： systolic blood pressure； MBP： mean blood pressure； DBP： diastolic blood pressure.**<0.01Wistar rats.

Western blot結(jié)果顯示，SHR組左心房組織中的Piezo1表達(dá)水平顯著高于Wistar組（<0.01），見(jiàn)圖2。這表明高血壓促進(jìn)心臟組織Piezo1蛋白表達(dá)。

Figure 2.The protein expression of Piezo1 in left atrial tissue of Wistar and SHR. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs Wistar.

3　高靜水壓處理對(duì)小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

借助課題組自行研制的自加壓裝置，將小鼠心房成纖維細(xì)胞置于不同壓力（0、20及40 mmHg）下培養(yǎng)48 h［9］，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子Col1A1/3A1和MMP-2/9表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著壓力升高，機(jī)械門控離子通道Piezo1表達(dá)水平顯著升高（<0.05）；Src表達(dá)量稍有升高，但無(wú)顯著差異，p-Src蛋白水平在20 mmHg及40 mmHg下均有升高，以20 mmHg組最顯著（<0.01）；纖維化相關(guān)蛋白Col1A1/3A1水平隨壓力梯度逐漸升高（<0.05），MMP-2表達(dá)量也顯著升高，以20 mmHg升高最為顯著（<0.05），MMP-9表達(dá)量在40 mmHg升高最顯著（<0.01），見(jiàn)圖3。

Figure 3.The protein expression of Piezo1， Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts cultured with different pressure. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05，** P<0.01 vs 0 mmHg group.

4　GsMTx4對(duì)高靜水壓所致的小鼠心房成纖維細(xì)胞Src激活及纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)增加的影響

為了確定Piezo1在高靜水壓與心房成纖維細(xì)胞纖維化中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，我們?cè)?0 mmHg壓力下，以不同濃度（1、3和10 μmol/L）Piezo1抑制劑GsMTx4［9］處理心房成纖維細(xì)胞48 h，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GsMTx4處理組細(xì)胞中Piezo1和Src/p-Src表達(dá)量呈濃度依賴性下降，以高濃度顯著（<0.05），p-Src蛋白水平在3和10μmol/L組均顯著下降（<0.01）；GsMTx4亦可明顯逆轉(zhuǎn)高靜水壓所致纖維化指標(biāo)Col1A1、Col3A1及MMP-2/9表達(dá)增加（<0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4.Effects of GsMTx4 on the expression of Piezo1， Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts at 40 mmHg. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs 0 μmol/L group.

5　敲減Piezo1對(duì)高靜水壓下小鼠心房成纖維細(xì)胞中Src/p-Src和纖維化蛋白表達(dá)及細(xì)胞活力的影響

為了進(jìn)一步探索Piezo1在高靜水壓與心房成纖維細(xì)胞纖維化中的作用，我們?cè)?0 mmHg壓力下，對(duì)小鼠心房成纖維細(xì)胞行siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染降低Piezo1的表達(dá)，觀察Src/p-Src和纖維化因子表達(dá)及細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Piezo1表達(dá)量顯著下降（<0.05），提示敲減成功；p-Src蛋白水平也顯著降低（<0.05），Src蛋白水平輕微降低，無(wú)顯著差異；與negative control組相比，敲減后，纖維化指標(biāo)Col1A1和MMP-2/9亦顯著降低（<0.05）；CCK-8結(jié)果顯示，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染初期（0、12和24 h），兩組值無(wú)顯著差異，培養(yǎng)至48及72 h后，siRNA組值顯著低于negative control組（<0.01），見(jiàn)圖5。

Figure 5.Effects of Piezo1 siRNA on the expression of Src/p-Src and fibrosis-related factors， and cell viability in mouse atrial fibroblasts at 40 mmHg. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9； J： A value （at 450 nm） changes of the cells transfected with negative control or Piezo1 siRNA under high hydrostatic pressure. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs negative control group.

6　PP1干預(yù)對(duì)高靜水壓所致小鼠心房成纖維細(xì)胞纖維化的影響

為了探索Src在高血壓與心房纖維化中的作用，我們?cè)?0 mmHg下，以不同濃度（5和10 μmol/L）的Src抑制劑PP1處理心房成纖維細(xì)胞48 h，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Src/p-Src及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)。與0 mmHg組相比，高靜水壓（40 mmHg）組p-Src表達(dá)量顯著上升（<0.05），加入PP1后p-Src表達(dá)量顯著下降，以10 μmol/L組明顯（<0.05）；Src蛋白水平有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異；纖維化指標(biāo)Col1A1/3A1和MMP-2/9蛋白水平在40 mmHg組顯著上升（<0.05），PP1處理后纖維化因子Col1A1/3A1和MMP-2/9表達(dá)量呈濃度依賴性遞減，以10 μmol/L組下降最顯著（<0.01），見(jiàn)圖6。

Figure 6.Effects of PP1 on the expression of Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts at 0 mmHg or 40 mmHg. A and B： representative immunoblots of Src/p-Src and fibrosis-related factors； C： the level of p-Src； D： the level of Src； E： the level of Col1A1； F： the level of Col3A1； G： the level of MMP-2； H： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. #P<0.05， ##P<0.01 vs 0 mmHg group； *P<0.05， **P<0.01 vs DMSO group.

7　Yoda1對(duì)小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1、Src/p-Src及纖維化蛋白表達(dá)的影響

以不同濃度（1、3和10 μmol/L）的特異性Piezo1激動(dòng)劑Yoda1［10］處理心房成纖維細(xì)胞48 h，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Piezo1、Src/p-Src及纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與DMSO組相比，Yoda1干預(yù)組的小鼠心房成纖維細(xì)胞Piezo1表達(dá)量呈濃度依賴性升高，以10 μmol/L蛋白水平達(dá)到最高（<0.05）；p-Src在10 μmol/L時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高（<0.05），而Src無(wú)顯著差異；纖維化蛋白Col1A1和MMP-2在高濃度Yoda1（10 μmol/L）處理組表達(dá)量顯著升高（<0.01），而MMP-9在3 μmol/L濃度下蛋白水平升高最顯著（<0.05），Col3A1雖有升高趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖7。

Figure 7.Effects of Yoda1 on the expression of Piezo1， Src/p-Src and fibrosis-related factors in mouse atrial fibroblasts. A and B： representative immunoblots of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis-related factors； C： the level of Piezo1； D： the level of p-Src； E： the level of Src； F： the level of Col1A1； G： the level of Col3A1； H： the level of MMP-2； I： the level of MMP-9. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs DMSO group.

討論

以上研究表明，高靜水壓激活心房成纖維細(xì)胞中的機(jī)械敏感通道Piezo1，Src蛋白表達(dá)水平及磷酸化增加，最后導(dǎo)致細(xì)胞中的纖維化相關(guān)因子水平升高。抑制Piezo1功能可顯著降低Src和p-Src的表達(dá)，減少纖維化相關(guān)蛋白的分泌；敲減可以顯著抑制小鼠心房成纖維細(xì)胞的增殖。Src特異性抑制劑PP1可顯著抑制心房成纖維細(xì)胞中的纖維化相關(guān)蛋白分泌。應(yīng)用Piezo1特異性激動(dòng)劑Yoda1可使細(xì)胞內(nèi)Src/p-Src及纖維化相關(guān)因子水平升高。說(shuō)明小鼠心房成纖維細(xì)胞中Piezo1/Src在高靜水壓所致的心房纖維化中起重要作用。

高血壓患者左心房壓力增加，心房壁緊張度增加，其主要的機(jī)械應(yīng)力變化為靜水壓和牽張力的增加。且高血壓可導(dǎo)致心房纖維化，房性心律失常易感性增加［11］。MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有蛋白，在組織和細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起著基礎(chǔ)性的作用，參與器官擴(kuò)張和結(jié)構(gòu)重塑?；罨腗MP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中起重要作用。在體研究表明，機(jī)械負(fù)荷的變化與細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)有關(guān)，機(jī)械力的增加有助于細(xì)胞外基質(zhì)成分的表達(dá)和沉積或纖維化的增強(qiáng)，病理性纖維化可導(dǎo)致許多器官系統(tǒng)功能障礙［12］。但高靜水壓如何轉(zhuǎn)變成生物信號(hào)，導(dǎo)致纖維化相關(guān)因子的分泌增加，參與房顫的病理過(guò)程，尚未見(jiàn)報(bào)道。

機(jī)械門控通道蛋白Piezo1通過(guò)直接的膜張力進(jìn)行門控，任何改變膜張力的生理作用力都可激活通道，如戳刺、拉伸、流體剪切力等。人造液滴脂質(zhì)雙分子層實(shí)驗(yàn)表明，Piezo1的機(jī)械敏感性是固有的，不需要其他蛋白質(zhì)或第二信使信號(hào)激活［13］。Piezo1也可借助附屬蛋白調(diào)節(jié)通道的敏感性，如在觸覺(jué)敏感細(xì)胞中，Piezo1與氣孔素樣蛋白3（stomatin-like protein 3， STOML3）相互作用，從而調(diào)節(jié)Piezo1通道，極大地提高了Piezo1的敏感性［14］。Piezo1在心血管系統(tǒng)中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈血流激活血管壁的Piezo1通道，內(nèi)皮細(xì)胞釋放ATP，同時(shí)激活P2Y2/Gq/G11通路，調(diào)控NO生成，調(diào)節(jié)血管收縮反應(yīng)［15］。本研究表明，高靜水壓激活小鼠心房成纖維細(xì)胞的Piezo1通道，繼而調(diào)控纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)重塑。由此證實(shí)Piezo1在高血壓所致纖維化中起著重要作用。

此外，本研究還探索了Src激酶在連接Piezo1和纖維化中的作用。Src是細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸激酶成員之一，是具有代表性的一種非受體膜結(jié)合酪氨酸激酶，在各種細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，是許多基本生命活動(dòng)所需級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要節(jié)點(diǎn)。Src也參與細(xì)胞纖維化的過(guò)程。有研究顯示，Src激酶介導(dǎo)單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎間質(zhì)纖維化，機(jī)制研究Src激酶通過(guò)激活ERK和Akt促進(jìn)腎肌成纖維細(xì)胞聚集、促纖維化因子分泌和炎癥反應(yīng)［16］。在Graves眼病中，Src通過(guò)TGF-β/Smad、NF-κB及PI3K/Akt等信號(hào)通路誘導(dǎo)眶成纖維化細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞，繼而分泌促纖維化因子，引起眼外肌纖維化［17］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，高靜水壓下的小鼠心房成纖維細(xì)胞中Src和p-Src表達(dá)量升高，并促進(jìn)纖維化蛋白分泌，細(xì)胞外基質(zhì)重塑。但高靜水壓下Piezo1如何激活Src，仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究初步證實(shí)機(jī)械力敏感通道蛋白Piezo1可能通過(guò)激活Src參與小鼠心房成纖維細(xì)胞高靜水壓相關(guān)纖維化，最終導(dǎo)致AF的發(fā)生和發(fā)展。

（致謝：本研究在廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部心血管藥理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，在此非常感謝各位實(shí)驗(yàn)室成員對(duì)本實(shí)驗(yàn)研究所付出的艱辛和努力！）

［1］ Wang Z， Chen Z， Wang X， et al. The disease burden of atrial fibrillation in China from a national cross-sectional survey［J］. Am J Cardiol， 2018， 122（5）：793-798.

［2］ Grundvold I， Skretteberg PT， Liest?l K， et al. Upper normal blood pressures predict incident atrial fibrillation in healthy middle-aged men： a 35-year follow-up study［J］. Hypertension， 2012， 59（2）：198-204.

［3］ Carver W， Goldsmith EC. Regulation of tissue fibrosis by the biomechanical environment［J］. Biomed Res Int， 2013， 2013：101979.

［4］ Beech DJ， Kalli AC. Force sensing by piezo channels in cardiovascular health and disease［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2019， 39（11）：2228-2239.

［5］ Ridone P， Vassalli M， Martinac B. Piezo1 mechanosensitive channels： what are they and why are they important［J］. Biophys Rev， 2019， 11（5）：795-805.

［6］ Retailleau K， Duprat F， Arhatte M， et al. Piezo1 in smooth muscle cells is involved in hypertension-dependent arterial remodeling［J］. Cell Rep， 2015， 13（6）：1161-1171.

［7］ Liang J， Huang B， Yuan G， et al. Stretch-activated channel Piezo1 is up-regulated in failure heart and cardiomyocyte stimulated by Ang Ⅱ［J］. Am J Transl Res， 2017， 9（6）：2945-2955.

［8］ Wang X， Ren R， Xu Z， et al. Tirbanibulin attenuates pulmonary fibrosis by modulating Src/STAT3 signaling［J］. Front Pharmacol， 2021， 12：693906.

［9］何蘇月， 馬卓琳， 范昕然， 等. 機(jī)械敏感性離子通道Piezo1參與慢性避水應(yīng)激腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟高敏感性和5-羥色胺代謝異常［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2021， 37（4）：577-585.

He S， Ma Z， Fan X， et al. Mechanosensitive piezo1 channel is involved in visceral hypersensitivity and abnormal 5-HT metabolism of rats with irritable bowel syndrome induced by chronic water avoidance stress［J］. Chin J Pathophysiol， 2021， 37（4）：577-585.

［10］ 劉佳麗， 徐攀高， 張蕾， 等. 機(jī)械敏感性離子通道Piezo1在心血管疾病中的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)病理生理雜志， 2021， 37（7）：1310-1316.

Liu J， Xu P， Zhang L， et al. Research progress of mechanosensitive ion channel Piezo1 in cardiovascular diseases［J］. Chine J Pathophysiol， 2021， 37（7）：1310-1316.

［11］ Choisy SC， Arberry LA， Hancox JC， et al. Increased susceptibility to atrial tachyarrhythmia in spontaneously hypertensive rat hearts［J］. Hypertension， 2007， 49（3）：498-505.

［12］ Carver W， Goldsmith EC. Regulation of tissue fibrosis by the biomechanical environment［J］. Biomed Res Int， 2013， 2013：101979.

［13］ Syeda R， Florendo MN， Cox CD， et al. Piezo1 channels are inherently mechanosensitive［J］. Cell Rep， 2016， 17（7）：1739-1746.

［14］ Poole K， Herget R， Lapatsina L， et al. Tuning piezo ion channels to detect molecular-scale movements relevant for fine touch［J］. Nat Commun， 2014， 5：3520.

［15］ Wang S， Chennupati R， Kaur H， et al. Endothelial cation channel piezo1 controls blood pressure by mediating flow-induced ATP release［J］. J Clin Invest， 2016， 126（12）：4527-4536.

［16］ Takano H， Zou Y， Hasegawa H， et al. Oxidative stress-induced signal transduction pathways in cardiac myocytes： involvement of ROS in heart diseases［J］. Antioxid Redox Signal， 2003， 5（6）：789-794.

［17］ Hao M， Sun J， Zhang Y， et al. Exploring the role of src in extraocular muscle fibrosis of the Graves' ophthalmopathy［J］. Front Bioeng Biotechnol， 2020， 8：392.

Involvement of mechanically activated Piezo1 channels in atrial fibrosis induced by elevated hydrostatic pressure

LIU Hui-yi1， RAO Fang1， YE Xing-dong1， JIN Shu-yu1，2， FU Lu1， DENG Chun-yu1， YANG Hui1， KUANG Su-juan1， WU Shu-lin1， XUE Yu-mei1△

（1，，，，510080，；2，，510515，）

To investigate the role and possible mechanism of mechanosensitive ion channel Piezo1 in hypertension-induced atrial fibrosis and even atrial fibrillation.Primary atrial fibroblasts from 6-to-8-week-old male C57BL/6 mice were isolated and cultured by enzyme digestion， and the cell hypertension model was established using self-made pressure device. Western blot analysis was conducted to compare the expression levels of Piezo1， Src/p-Src， and fibrosis indicators collagen type I/III α1 chain （Col1A1/3A1） and matrix metalloproteinase-2/9 （MMP-2/9） in the cells under different pressure interventions （0， 20 and 40 mmHg）. At 40 mmHg， the cells were given different concentrations （1， 3 and 10 μmol/L） of ion channel inhibitor GsMTx4 orsiRNA， or Src inhibitor PP1 （5 and 10 μmol/L）， and the changes of Src/p-src and fibrosis-related factor protein levels were observed. The changes of Src/p-Src and fibrosis-related factor protein levels were also observed when the cells were given different concentrations of Piezo1-specific agonist Yoda1 （1， 3 and 10 μmol/L）.Higher hydrostatic pressure （20 and 40 mmHg） increased the expression of Piezo1 and Src in mouse atrial fibroblasts （<0.05）， accompanied by increases in Src/p-Src， and fibrosis indicators Col1A1/3A1 and MMP-2/9. GsMTx4，siRNA or PP1 significantly reversed the above changes （<0.05）. In addition， Piezo1 agonist Yoda1 simulated the changes of electrical remodeling and related signal molecules in atrial myocytes induced by high hydrostatic pressure （<0.05）.Mechanosensitive ion channel Piezo1/Src kinase signaling pathway is activated during hypertension， leading to the decreases in Col1A1/3A1 and MMP-2/9 and the electrical remodeling of atrial myocytes.

Piezo1 protein； Hypertension； Atrial fibroblasts； Atrial fibrillation

R541.7+5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.002

1000-4718（2022）03-0394-09

2021-09-24

2021-12-06

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81870254）

Tel： 020-83827812； E-mail： xymgdci@163.com

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）