牛姝 張寧 王媛 張弛 張夢(mèng)瑤 田碩 趙志剛

結(jié)直腸癌(CRC)是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康，它的發(fā)病率已經(jīng)占惡性腫瘤的第3位，病死率繼肺、肝、胃、食管后第5位[1]。近年來(lái)隨著生活水平的提高和人口老齡化，我國(guó)2型糖尿病患者呈上升趨勢(shì)。2型糖尿病現(xiàn)在已成為世界性非傳染性流行病，全世界現(xiàn)有確診糖尿患者約2.2億。多項(xiàng)研究顯示，2型糖尿病不但可誘發(fā)和加重多種全身性疾病，如心腦血管系統(tǒng)疾病，更有增加惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，2型糖尿病影響CRC的發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后[2]。但這一風(fēng)險(xiǎn)性增加的可能機(jī)制仍不十分明確。ERK1/2可以將多種細(xì)胞外信號(hào)，經(jīng)過(guò)磷酸化活化逐級(jí)傳遞至細(xì)胞核，并激活多種核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂及分化等[3,4]，是多種生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)[5]、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)[6]、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)[7]等的下游蛋白，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中ERK及其信號(hào)途徑起中介和放大信號(hào)作用：接受來(lái)自絲裂原、生長(zhǎng)因子、環(huán)境刺激等的信號(hào)；通過(guò)ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如AP21、NF2kB等，調(diào)控基因表達(dá)[8,9]。因此探討糖尿病合并CRC中p-ERK1/2 的表達(dá)與臨床病理及患者生存的相關(guān)性具有重要的應(yīng)用前景，以期為腫瘤新的觀測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)進(jìn)一步理清思路，為結(jié)直腸癌的防治決策提供有益參考，從而進(jìn)一步指導(dǎo)患者的臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年3月至2017年1月石家莊市人民醫(yī)院病理科經(jīng)病理明確診斷的結(jié)直腸癌手術(shù)切除組織標(biāo)本59例，其中男37例，女22例；年齡≤50歲者4例，>50歲者55例。腫瘤最大直徑<5 cm者19例，≥5 cm者40例；T1～2期7例，T3～4期 52例；高、中分化47例，低分化12例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例。病理分期參照2010年第7版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。其中伴有2型糖尿病CRC患者29例(CRC/DM組)，不伴2型糖尿病CRC患者30例(CRC組)。CRC/DM組與CRC組患者在性別比、年齡等方面有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2010年WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類關(guān)于結(jié)直腸腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后組織病理檢查確診為結(jié)直腸腺癌；②采取手術(shù)治療；③所有患者術(shù)前均未接受放化療、放療以及其他抗腫瘤治療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤的患者；②合并1型糖尿病的患者。

1.3 病理資料 復(fù)習(xí)切片，選擇用于免疫組化研究的腫瘤組織；復(fù)習(xí)所有切片，選擇無(wú)明顯退變壞死的存檔石蠟包埋腫瘤組織。

1.4 免疫組化及結(jié)果評(píng)估 免疫組化染色方法：采用免疫組化SP法檢測(cè)59例手術(shù)切除癌組織中P-ERK1/2的表達(dá)。鼠抗人P-ERK1/2磷酸化單克隆抗體和SP試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)于北京中杉金橋生物公司，所有流程按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行染色。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶免疫組化法(Streptavidin-Peroxidase,SP),癌組織標(biāo)本采用甲醛溶液固定24 h、脫水、常規(guī)石蠟包埋，制作成4 μm厚的石蠟組織切片，常規(guī)脫蠟至水化后，60℃烤箱烤片2 h。經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯，水化后，進(jìn)行S-P免疫組織化學(xué)染色，P-ERK1/2的一抗稀釋度為1∶100，二抗的稀釋度1∶200。采用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，北京中杉金橋公司提供的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：所有切片均由2位病理科資深醫(yī)生雙盲閱片，2位專家意見(jiàn)不一致時(shí)請(qǐng)第3位病理學(xué)醫(yī)生閱片，最終確定結(jié)果。P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色或黃色顆粒。P-ERK1/2陽(yáng)性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：先按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比打分，陽(yáng)性細(xì)胞百分率<5%為0分，5%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；再按細(xì)胞的著色強(qiáng)度打分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，參考Zhong等[10]的報(bào)道：陽(yáng)性細(xì)胞百分比與細(xì)胞的著色強(qiáng)度乘積：評(píng)分≤3分為(-)，>3分為(+)。

1.5 隨訪 隨訪截止2020年1月，對(duì)所有手術(shù)患者進(jìn)行隨訪術(shù)后36個(gè)月患者的生存情況，生存時(shí)間定義為術(shù)后到患者死亡的時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，2組間計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，關(guān)聯(lián)分析采用Spearman相關(guān)分析方法，采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存率相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P-ERK1/2在CRC組和CRC/DM組癌組織中的表達(dá)情況 P-ERK1/2棕黃色或黃色顆粒主要在細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。30例CRC組的癌組織中有5例P-ERK1/2表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為16.6%；29例CRC/DM組的癌組織中有12例P-ERK1/2表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為41.4%，CRC/DM組P-ERK1/2蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于CRC組(χ2=4.390，P=0.036)。見(jiàn)圖1。

CRC組CRC/DM組

2.2 P-ERK1/2表達(dá)與CRC組和CRC/DM組癌組織臨床病理特征相關(guān)性

2.2.1 CRC組P-ERK1/2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系：CRC組P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)5例，與患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤長(zhǎng)徑、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CRC組癌組織中P-ERK1/2的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.2.2 CRC/DM組P-ERK1/2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系：CRC/DM組P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)有12例，與患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤長(zhǎng)徑、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CRC/DM組癌組織中P-ERK1/2的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.2.3 所有患者P-ERK1/2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系：不考慮糖尿病，在所有59例患者中P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)有17例，P-ERK1/2蛋白陰性表達(dá)有42例。女性組10例P-ERK1/2表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為45.5%，男性組7例P-ERK1/2表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為18.9%，女性組P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于男性組(χ2=4.736，P=0.03)。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組14例P-ERK1/2表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為41.2%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組3例P-ERK1/2表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為12%，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=5.979，P=0.014)；P-ERK1/2的表達(dá)與患者的年齡、分化程度、腫瘤長(zhǎng)徑、T分期均無(wú)相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 所有癌組織中P-ERK1/2的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 CRC組和CRC/DM組患者術(shù)后生存時(shí)間和生存率比較 對(duì)所有手術(shù)患者隨訪手術(shù)后36個(gè)月患者的生存情況，Kaplan-Meier 生存分析及 Log-rank 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)59例患者隨訪，隨訪時(shí)間為1～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為29個(gè)月。30例CRC組患者中有12例死亡，病死率為40%，29例CRC/DM組患者中有23例死亡，病死率為79.3%，CRC/DM組患者術(shù)后病死率明顯大于CRC組(χ2=9.443，P=0.002)。CRC組的中位生存時(shí)間是26個(gè)月，CRC/DM組中位生存時(shí)間是19個(gè)月，CRC組患者手術(shù)后生存時(shí)間明顯大于CRC/DM組(P=0.0304)。CRC/DM組患者較CRC組患者生存率低，病死率高，采用Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析，兩條生存曲線明顯分開(kāi)(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 CRC組和CRC/DM組患者手術(shù)后生存時(shí)間比較

2.4 所有患者P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)手術(shù)后患者生存率比較 不考慮糖尿病，在所有59例患者中P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)有17例，有10例死亡，病死率為58.8%；P-ERK1/2蛋白陰性表達(dá)有42例，有25例死亡，病死率為59.5%。P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)組的中位生存時(shí)間是22個(gè)月，而P-ERK1/2蛋白陰性表達(dá)組的中位生存時(shí)間是21個(gè)月，P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)組與陰性表達(dá)組死亡率無(wú)明顯差異(P=0.988)。見(jiàn)圖3。

圖3 P-ERK1/2蛋白陽(yáng)性表達(dá)組和陰性表達(dá)組手術(shù)后生存時(shí)間比較

3 討論

伴隨著社會(huì)的進(jìn)步，腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素、多步驟綜合調(diào)控、復(fù)雜作用的結(jié)果。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2是一類屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，它是一種具有傳導(dǎo)絲裂原信號(hào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)性蛋白。ERK1/2能夠接受各自環(huán)境刺激、生長(zhǎng)因子或者絲裂原等信號(hào)，并且通過(guò)ERK信號(hào)通路，可以把接受的信號(hào)進(jìn)行級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并作用于下游因子，最終達(dá)到基因表達(dá)的調(diào)控。磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)是其活化形式，一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及腫瘤啟動(dòng)子通過(guò)Ras/Raf/MEK/ERK途徑磷酸化激活ERK1/2，活化的ERK1/2(P-ERK1/2)將胞漿內(nèi)信號(hào)導(dǎo)入胞核，作用于c-jun、c-fos、c-Myc、ElK-1等轉(zhuǎn)錄因子及核蛋白，促進(jìn)多種癌基因及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。P-ERK1/2通路異?；罨崾灸[瘤細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)較為活躍，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞增殖加快，容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，對(duì)化療、放療的敏感性降低，患者生存時(shí)間縮短[11]。研究發(fā)現(xiàn)RAS→RAF→MAPK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和惡性程度密切相關(guān)，貫穿在腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段[12]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂、基因表達(dá)。MAPKs是一個(gè)蛋白激酶家族，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了5條并行的信號(hào)通路，其中ERK1/2級(jí)聯(lián)通路被認(rèn)為是經(jīng)典的MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。既往的臨床研究表明，糖尿病(尤其是2型糖尿病)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[13]。事實(shí)上，薈萃分析已經(jīng)證實(shí)2型糖尿病是幾種不同類型腫瘤發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Larsson等[14]的研究結(jié)論支持糖尿病患者的結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)高于非糖尿病患者。Ren等[15]研究結(jié)果顯示，在7 938例2型糖尿病患者中就有64例患有結(jié)直腸癌(44例結(jié)腸癌和20例直腸癌)，其粗發(fā)病率為314.8/10萬(wàn)，其發(fā)病率顯著高于普通人群。本研究結(jié)果顯示，CRC/DM組的癌組織中P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率為41.4%，CRC組的癌組織中P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率為16.6%，CRC/DM組中P-ERK1/2的表達(dá)率明顯高于CRC組，提示2型糖尿病結(jié)直腸癌的發(fā)生可能與P-ERK1/2的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)，進(jìn)一步證明磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2蛋白在合并2型糖尿病CRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)論[12]一致。

在許多研究中提示RAS→RAF→MAPK信號(hào)通路可能直接或間接與女性激素相關(guān)，女性激素對(duì)乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等致病因素已有定論[16]。本研究提示P-ERK1/2磷酸化高表達(dá)與腫瘤的性別差異有相關(guān)性。不考慮患者有無(wú)糖尿病，在所有病例女性患者中P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率為45.5%，男性為18.9%，女性組P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于男性組。但女性激素是否也是結(jié)直腸癌的發(fā)病因素，尚需大量臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，本研究結(jié)果顯示：P-ERK1/2表達(dá)與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。提示P-ERK1/2在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌人群中檢測(cè)更有意義，一旦發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，該指標(biāo)可能檢測(cè)意義不大。由于本樣本量較小，在今后的研究中需要進(jìn)一步加大樣本量完成機(jī)制方面的研究。

Meyerhardt等[17]的研究顯示，結(jié)直腸癌合并2型糖尿病的患者與無(wú)糖尿病相比，其結(jié)直腸癌的治愈率更低，總體生存率更低，復(fù)發(fā)率較高，結(jié)直腸癌合并糖尿病組的平均生存時(shí)間比對(duì)照組少5.3年。Dehal等[18]對(duì)2 278例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了10多年的隨訪，結(jié)果顯示，合并2型糖尿病患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非糖尿病患者。其機(jī)制可能為2型糖尿病的高胰島素血癥可通過(guò)影響胰島素-胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor-1,IGF-1)軸以及胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白增加血清IGF-1水平，該因子可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，與結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。之前筆者曾經(jīng)做過(guò)研究顯示：IGF1R和Ras蛋白在CRC/DM組患者癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于CRC組，并且具有IGF1R+ Ras+免疫表型患者所占的比例明顯高于CRC組，二者的表達(dá)呈正相關(guān)[19]。提示IGF1R/Ras通路可能在合并2型糖尿病CRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。我們通過(guò)對(duì)P-ERK1/2信號(hào)下游及IGF1R+ 信號(hào)下游的分子進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)有大多數(shù)的共同信號(hào)分子：Ras基因，MEK，ERK1/2等，所以我們有理由相信P-ERK1/2與IGF1R+ 信號(hào)通路存在著某種聯(lián)系，共同參與了結(jié)直腸癌的發(fā)展。另外，本研究結(jié)果顯示，在CRC組的患者術(shù)后的中位生存時(shí)間是26個(gè)月，CRC/DM組的患者術(shù)后的中位生存時(shí)間是19個(gè)月，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0304，P<0.05) 。在CRC組患者術(shù)后36個(gè)月內(nèi)有40%(12/30)死亡，CRC/DM組患者術(shù)后36個(gè)月內(nèi)有79.3%(23/29)死亡，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們的研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]：結(jié)直腸癌合并2型糖尿病組的患者與單純結(jié)直腸癌組患者相比，其總體生存時(shí)間較低，病死率較高。這說(shuō)明2型糖尿病可能通過(guò)不同的通路參與了結(jié)直腸癌的發(fā)展。故臨床上應(yīng)重視2型糖尿病患者的結(jié)直腸癌篩查，Nagel等[20]建議，2型糖尿病患者應(yīng)定期進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，時(shí)間間隔不超過(guò)5年。重要的是血糖控制也是結(jié)直腸癌患者管理的根本策略，通過(guò)對(duì)血糖良好的控制，使結(jié)直腸癌患者有更多的獲益。由于樣本量較少，本研究存在一定程度的局限性，今后有必要進(jìn)一步增大樣本量來(lái)探討2型糖尿病對(duì)CRC發(fā)生發(fā)展的影響，并加強(qiáng)機(jī)制方面的研究，以期為臨床診療及預(yù)后評(píng)估提供更有價(jià)值的參考。

CRC/DM組磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2蛋白表達(dá)明顯高于CRC組，磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2蛋白可能參與了2型糖尿病患者發(fā)生CRC的過(guò)程；不考慮糖尿病，在所有59例病例中，女性組P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于男性組，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組P-ERK1/2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；2型糖尿病合并結(jié)直腸癌組患者與單純結(jié)直腸癌組患者相比，其總體生存時(shí)間較低，病死率較高。