文利偉 張誠 李建明 沈洪波

腦膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，腫瘤邊緣境界不清，不易切除，且切除后易復(fù)發(fā)，給患者造成沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)[1]。隨著科學(xué)的發(fā)展，靶向治療成為膠質(zhì)瘤治療的熱點(diǎn)及新方向[2]。研究表明lncRNA對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和其他惡性表型至關(guān)重要，可作為潛在的新型生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[3]。研究報(bào)道LINC00240與食管鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)[4]。LINC00240在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)LINC00240通過調(diào)控miR-124-3p/DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNA-methyltransferase-3B，DNMT3B)軸可抑制細(xì)胞增殖，侵襲和遷移，并且在體內(nèi)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的腫瘤發(fā)生[5]。然而LINC00240對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響筆者所見尚不清楚。有研究報(bào)道神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和組織中miR-656表達(dá)明顯下調(diào)；miR-656過表達(dá)通過抑制BMP受體1A型(BMP receptor type 1A，BMPR1A)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[6]。lncRNA NORAD通過吸附miR-656-3p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和遷移[7]。但miR-656-3p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響及LINC00240是否調(diào)控miR-656-3p影響膠質(zhì)瘤進(jìn)展尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究LINC00240是否通過調(diào)控miR-656-3p影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 正常人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088、Hs683購自ATCC；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；蛋白裂解液、BCA試劑盒購自美國Biomiga公司；MTT試劑盒購自日本同仁研究所；凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國biovision公司。

1.2 細(xì)胞處理與分組 正常的人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088、Hs683用RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞LN18，將si-NC、si-LINC00240、pcDNA-NC、pcDNA-LINC00240、miR-NC、miR-656-3p轉(zhuǎn)染至細(xì)胞LN18中，分別記為si-NC組、si-LINC00240組、pcDNA-NC組、pcDNA-LINC00240組、miR-NC組、miR-656-3p組；將si-LINC00240分別與anti-miR-NC、anti-miR-656-3p共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞LN18中，記為si-LINC00240+anti-miR-NC組、si-LINC00240+anti-miR-656-3p組。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測LINC00240、miR-656-3p的表達(dá)水平 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，按試劑盒說明進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入一抗和二抗孵育，抗體孵育結(jié)束后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，最后用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 MTT檢測細(xì)胞活性 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入MTT溶液，孵育后檢測490 nm處吸光度(OD)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，按試劑盒說明操作；上流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建野生型和突變型的LINC00240熒光素酶報(bào)告載體，將其分別與miR-NC和miR-656-3p共轉(zhuǎn)染至LN18細(xì)胞中，按試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中LINC00240和miR-656-3p表達(dá)情況 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088、Hs683中LINC00240表達(dá)水平高于正常人HEB，而miR-656-3p表達(dá)水平低于HEB(P<0.05)。見表1。

表1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-656-3p和LINC00240表達(dá)量

2.2 LINC00240低表達(dá)對(duì)LN18膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC00240組CyclinD1表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，LN18細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 LINC00240低表達(dá)對(duì)LN18膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；B CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表2 LINC00240低表達(dá)對(duì)LN18膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 miR-656-3p高表達(dá)對(duì)LN18膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-656-3p組LN18細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)水平降低，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平升高，LN18細(xì)胞的活性降低，凋亡率升高，5個(gè)指標(biāo)的組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 miR-656-3p高表達(dá)對(duì)LN18膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖2 CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.4 LINC00240靶向miR-656-3p LncBase Predicted v.2在線軟件預(yù)測顯示，miR-656-3p和LINC00240存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-656-3p與LINC00240野生型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)。與pcDNA-NC比較，pcDNA-LINC00240組miR-656-3p表達(dá)水平降低，與si-NC比較，si-LINC00240miR-656-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 LncBase Predicted v.2對(duì)miR-656-3p和LINC00240結(jié)合進(jìn)行預(yù)測示意圖

2.5 低表達(dá)miR-656-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00240低表達(dá)對(duì)LN18增殖和凋亡的影響 與si-LINC00240+anti-miR-NC組相比，si-LINC00240+anti-miR-656-3p組CyclinD1表達(dá)水平升高，Cleaved-caspase-3表達(dá)水平降低，LN18細(xì)胞活性升高，凋亡率降低(P<0.05)。見圖4，表6。

表4 雙熒光素酶活性檢測

表5 qRT-PCR檢測miR-656-3p的表達(dá)

圖4 CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表6 低表達(dá)miR-656-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00240低表達(dá)對(duì)LN18增殖和凋亡的影響

2.6 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 與si-NC組比較，si-LINC00240組p-p65、p-IкBα表達(dá)水平降低(P<0.05)；與si-LINC00240+anti-miR-NC組比較，si-LINC00240+anti-miR-656-3p組p-p65、p-IкBα表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖5，表7。

圖5 Western Blot檢測p-p65、p-IкBα蛋白的表達(dá)

表7 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

研究表明lncRNA參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程[8,9]。研究報(bào)道LINC00240在宮頸癌中表達(dá)增加，LINC00240增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的生長，遷移和侵襲；LINC00240過表達(dá)通過影響miR-124-3p/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)/MHC I類相關(guān)鏈A(MICA)軸抑制了自然殺傷性T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常人類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HEB相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18、SW1088、Hs683中LINC00240表達(dá)水平升高；低表達(dá)LINC00240后膠質(zhì)瘤細(xì)胞系LN18中CyclinD1的表達(dá)水平降低，LN18細(xì)胞活性降低，而凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平升高，LN18細(xì)胞的凋亡率升高。表明抑制LINC00240表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

另外，miRNA也可能與lncRNA相互作用并影響腫瘤的生長和發(fā)展[11]。有研究報(bào)道抑制lncRNA ANRIL可通過調(diào)節(jié)miR-656-3p/Y染色體上的性別決定區(qū)相關(guān)高遷移率族盒蛋4(SOX4)軸來提高非小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑的敏感性[12]。lncRNA PCAT1通過海綿miR-656和miR-539上調(diào)Yes相關(guān)蛋白(YAP)來促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-656-3p表達(dá)水平降低，miR-656-3p高表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。且LINC00240靶向miR-656-3p，低表達(dá)miR-656-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00240低表達(dá)對(duì)LN18細(xì)胞增殖、凋亡的影響。提示，LINC00240可能通過調(diào)控miR-656-3p影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡。

有研究報(bào)道核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的異常激活與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性改變密切相關(guān)，可為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療提供新的思路和靶點(diǎn)[14]。干擾轉(zhuǎn)錄激活因子5(ATF5)可下調(diào)NF-κB信號(hào)通路降低腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。阻斷LINC00152可以通過miR-612/AKT2/NF-κB通路損害間充質(zhì)表型來抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LINC00240低表達(dá)后p-p65、p-IкBα表達(dá)水平降低，表明低表達(dá)LINC00240可抑制NF-κB信號(hào)通路。而低表達(dá)miR-656-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00240低表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。

綜上所述，低表達(dá)LINC00240可能通過上調(diào)miR-656-3p調(diào)控NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。