王霞 桑飛 郭鑫 李偉

慢性盆腔炎是女性生殖系統常見的疾病之一，其發(fā)病機制與免疫因素、環(huán)境因素及年齡等多種原因有關[1]，由于目前臨床中經常應用的藥物治療方案效果并不理想且復發(fā)率高，所以對于慢性盆腔炎治療藥物的研發(fā)仍是當前工作重點。赤芍總苷是從中藥材赤芍中提取得到的多種單萜苷類化合物的總稱，已有的研究發(fā)現赤芍總苷具有抗腫瘤、抗血栓、抗炎等多種藥理作用[2-4]。NF-κB作為調節(jié)體內炎性反應的關鍵通路，其在慢性盆腔炎等多種婦科炎癥疾病發(fā)病過程中關鍵作用[5,6]。本實驗通過研究赤芍總苷對于慢性盆腔炎大鼠的炎癥抑制作用及對NF-κB通路的調節(jié)作用，旨在為赤芍總苷的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠[由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(新)2018-0002)]，雌性，7～8周齡，體重200～240 g，自由飲食，飼養(yǎng)于動物房。

1.2 藥品與試劑 赤芍總苷(西安澤邦生物科技有限公司，批號2020040321)；婦炎康(湖南湘泉制藥有限公司，批號2019121101)；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及解脲脲原體菌菌株(上海雅吉生物科技有限公司)；白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、細胞黏附分子1(ICAM-1)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)大鼠酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒、NF-κBp65及GAPDH兔單克隆抗體、IκKα兔多克隆抗體、ECL發(fā)光試劑盒、SYBR Green qPCR Mix試劑盒(碧云天生物科技公司，貨號PI328、PT516、PT878、PI495、PI615、PI525、S0103、S0131M、AF1234、AF1186、AF0198、P0018M、D7260)；IL-13(北京索萊寶科技有限公司，貨號SEKR-0046)；CD3、CD4、CD8熒光標記抗體(賽默飛世爾科技有限公司，貨號13-0037-82、13-0041-82、MA5-17595)；HE染色液(武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號G1005-500ML)，TransZol(北京全式金生物科技公司，貨號ET101-01)，PCR引物設計及合成(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

1.3 設備及儀器 Eclipse E100顯微鏡(日本Nikon公司)；Omega Fluor凝膠成像系統凝膠成像儀(美國Aplegen)；ELX800全自動酶標儀(北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)；RM2016輪轉式切片機(德國Leica公司)；Allegra X-15R臺式冷凍離心機(貝克曼庫爾特商貿有限公司)；Attune NxT流式細胞儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.4 造模、分組與給藥 72只大鼠隨機分為正常對照組、慢性盆腔炎組、赤芍總苷低、中、高劑量組及婦炎康組，12只/組，除正常對照組，其余大鼠參照文獻方法[7]，將含有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及解脲脲原體菌混合菌液的醫(yī)用明膠經陰道塞至左右宮腔內，各1片，將大鼠倒立3 min。隔天1次，連續(xù)3次，隨機取3只大鼠取子宮組織進行病理學檢查，以大鼠子宮組織出現明顯炎性浸潤及組織結構病理性改變視為造模成功。赤芍總苷低、中、高劑量組分別灌胃給予50、100、200 mg/kg[8]的赤芍總苷，婦炎康組給予420 mg/kg[9]的婦炎康，正常對照組及慢性盆腔炎組給予0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)21 d[9]。

1.5 觀察指標

1.5.1 血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1測定 腹腔注射給予大鼠40 mg/kg的戊巴比妥鈉進行麻醉，腹主動脈采血，4℃靜置2 h，3 500 r/min離心10 min，采用ELISA試劑盒檢測血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平。

1.5.3 子宮組織IL-4、IL-10、IL-13、SOD、MDA測定：大鼠處死后分離子宮組織，勻漿后離心，使用相應ELISA試劑盒測定子宮組織IL-4、IL-10、IL-13水平，WST-8法測定SOD水平，顯色法測定MDA水平。

1.5.4 HE染色：分離大鼠子宮組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，厚度為5 μm。切片用蘇木精染色5 min，蒸餾水洗凈，伊紅染色5 min，脫水后用中性樹脂封閉，在顯微鏡下觀察子宮組織形態(tài)。

1.5.5 RTq-PCR檢測大鼠子宮組織NF-κBp65及IκKα mRNA水平：取子宮組織提取RNA，用TransZol試劑提取總RNA，用試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。根據說明書方法，使用SYBR Green qPCR Mix試劑盒進行RTq-PCR。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算表達量。見表1。

表1 RTq-PCR各基因引物序列

1.5.6 Western blot：子宮組織加入裂解液，用勻漿器以3 000 r/min的速度勻漿60 s，在4℃，12 000 r/min的條件下離心10 min，收集上清液，得到總蛋白溶液，電泳分離，將蛋白轉移到聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，經1∶500稀釋后的NF-κBp65、IκKα及GAPDH抗體孵育過夜，次日經含吐溫磷酸鹽緩沖液洗滌后，將膜置于二抗在室溫下孵育30 min，再次洗滌后，取出條帶滴加顯影液，并使用凝膠分析系統及ImageJ軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 赤芍總苷對慢性盆腔炎大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1的影響 與正常對照組比較，慢性盆腔炎組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平升高(P<0.05)；與慢性盆腔炎組大鼠比較，赤芍總苷低、中、高劑量組及婦炎康組大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平降低(P<0.05)，且隨著赤芍總苷劑量的增加，大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平逐漸降低。見表2。

表2 大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β1、ICAM-1水平

2.2 赤芍總苷對大鼠子宮組織IL-4、IL-10、IL-13、SOD、MDA的影響 與正常對照組比較，慢性盆腔炎組大鼠子宮組織IL-4、IL-10、IL-13、SOD水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)；與慢性盆腔炎組比較，赤芍總苷低、中、高劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織IL-4、IL-10、IL-13、SOD水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，且赤芍總苷不同劑量組內比較，差異亦有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠子宮組織IL-4、IL-10、IL-13、SOD水平

2.3 赤芍總苷對慢性盆腔炎大鼠子宮組織病理形態(tài)學影響 病理形態(tài)學檢查結果表明，正常對照組大鼠子宮組織腺體結構正常，未見充血和水腫；慢性盆腔炎組大鼠子宮內膜變薄，結構紊亂，大量炎性細胞浸潤，子宮內膜充血水腫；與慢性盆腔炎組比較，赤芍總苷低、中、高劑量組及婦炎康組大鼠黏膜上皮細胞排列整齊，子宮內膜充血水腫明顯減輕，炎性細胞浸潤減輕，子宮病變有所恢復。見圖1。

正常對照組慢性盆腔炎組赤芍總苷低劑量組赤芍總苷中劑量組赤芍總苷高劑量組婦炎康組

表4 大鼠外周血細胞水平

2.5 赤芍總苷對慢性盆腔炎大鼠子宮組織NF-κBp65及IκKα mRNA水平影響 與正常對照組比較，慢性盆腔炎組大鼠子宮組織NF-κBp65mRNA水平升高(P<0.05)，IκKα mRNA水平降低(P<0.05)；與慢性盆腔炎組比較，赤芍總苷低、中、高劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織NF-κBp65mRNA水平降低(P<0.05)，IκKα mRNA水平升高(P<0.05)，且隨著赤芍總苷劑量的增加，大鼠子宮組織NF-κBp65mRNA水平逐漸降低，IκKα mRNA水平逐漸升高。見表5。

表5 大鼠子宮組織NF-κBp65及IκKα mRNA水平

2.6 赤芍總苷對慢性盆腔炎大鼠子宮組織NF-κBp65及IκKα蛋白表達的影響 與正常對照組比較，慢性盆腔炎組大鼠子宮組織NF-κBp65水平升高(P<0.05)，IκKα 水平降低(P<0.05)；與慢性盆腔炎組比較，赤芍總苷低、中、高劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織NF-κBp65水平降低(P<0.05)，IκKα水平升高(P<0.05)，且隨著赤芍總苷劑量的增加，大鼠子宮組織NF-κBp65水平逐漸降低，IκKα水平逐漸升高。見圖2，表6。

圖2 赤芍總苷對慢性盆腔炎大鼠子宮組織NF-κBp65及IκKα蛋白表達的影響

表6 大鼠子宮組織NF-κBp65及IκKα蛋白水平比較

3 討論

慢性盆腔炎作為女性常見的內生殖器及盆腔腹膜慢性炎癥之一，是由于機體免疫力下降，同時細菌及病毒等感染引起[11]，臨床表現為下腹脹痛、月經紊亂以及發(fā)熱等全身癥狀，并可能會對女性生育能力造成一定程度的影響。近年來研究發(fā)現，慢性盆腔炎與宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌等多種婦科腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展相關[12,13]?；旌暇臃N法是目前實驗室建立慢性盆腔炎動物模型的主要方法之一[14]，該方法簡單易行，成功率高，并且與人類慢性盆腔炎疾病進展相似，故本實驗采用此種方法建立大鼠模型。婦炎康是目前臨床中應用的治療慢性盆腔炎的藥物之一[15]，本實驗用其作為陽性對照藥物。

近年來研究發(fā)現赤芍總苷具有較強的抗炎及抗氧化應激等多種藥理作用[4]，肖文豪等[16]研究表明，赤芍總苷能夠降低大鼠超敏C-反應蛋白水平，并升高一氧化氮水平，進而改善自發(fā)性高血壓大鼠體內炎癥水平；楊霞等[17]研究發(fā)現赤芍總苷能夠通過促進炎性T細胞凋亡，抑制扁平苔蘚患者體內炎癥的發(fā)生發(fā)展；高雪巖等[18]報道了赤芍總苷具有顯著的抗氧化損傷及自由基清除作用，進而發(fā)揮其較強的抗炎作用，由此可見赤芍總苷具有較強的抗炎性反應的潛力。

IL-6及TNF-α作為體內重要的炎性因子[19]，在慢性盆腔炎的發(fā)病過程中起著重要作用；TGF-β1作為免疫抑制因子，能夠抑制體內免疫活性細胞的增殖，進而加速炎性反應的速度及進展[20]；ICAM-1是介導黏附反應重要黏附分子，能夠促進白細胞、炎性細胞等在炎癥部位的黏附性增強[21]。謝紫燁等[22]研究表明慢性盆腔炎大鼠血清及子宮組織內IL-6及TNF-α水平升高，并表明其在慢性盆腔炎的疾病進展中起到促進作用。Zhang等[23]研究表明TGF-β1及ICAM-1水平在慢性盆腔炎大鼠體內明顯升高，而抑制其水平的升高能夠明顯抑制炎性反應進展，并促進炎性細胞凋亡。

IL-4、IL-10、IL-13作為抗炎性因子，其水平的降低是慢性盆腔炎發(fā)病及進展的重要影響因子，提高IL-4、IL-10、IL-13水平能夠降低慢性盆腔炎大鼠炎性反應[26]，改善預后。

SOD及MDA水平是體內氧化應激損傷的標志物，SOD水平降低及MDA水平升高均會誘導或加重氧化損傷[27]，進而促進體內炎性介質的產生，段楊平等[28]指出慢性盆腔炎患者體內SOD水平明顯降低，MDA水平升高，而使用逍遙丸則能夠升高SOD水平，降低MDA水平，提高慢性盆腔炎患者的治愈率。本實驗結果表明，赤芍總苷能夠通過調節(jié)體內炎性因子及抗炎性因子的水平，抑制子宮組織氧化應激損傷，進而抑制慢性盆腔炎大鼠疾病進展。

已有大量文獻表明，NF-κB在慢性盆腔炎等炎癥性疾病的發(fā)病過程中起重要作用，機體受到細菌、病毒等病原體感染后，NF-κB作為炎性反應的中心介質，可以被各種病原體激活，并調節(jié)免疫反應中涉及的促炎細胞因子的水平[29]。因此，抑制NF-κB通路相關蛋白的激活，降低炎性因子水平，可能是慢性盆腔炎的潛在治療靶點。谷風等[30]研究表明慢性盆腔炎大鼠子宮組織NF-κBp65蛋白水平升高，IκKα表達降低，而抑制慢性盆腔炎大鼠體內NF-κBp65水平，提高IκKα水平則促進了炎性細胞的凋亡，抑制盆腔炎癥的發(fā)生；呂耀中等[31]也報道了慢性盆腔炎大鼠體內NF-κBp65的異常激活參與子宮組織炎性反應及纖維化發(fā)生發(fā)展，而抑制NF-κBp65能夠抑制慢性盆腔炎大鼠細胞外基質合成，促進纖維化修復。本實驗結果表明，與慢性盆腔炎大鼠比較，赤芍總苷低、中、高劑量組及婦炎康組大鼠子宮組織NF-κBp65mRNA水平及蛋白表達降低，IκKα mRNA水平及蛋白表達升高，這提示赤芍總苷能夠呈劑量依賴性地抑制NF-κB的過度激活，進而抑制慢性盆腔炎大鼠體內炎性反應進展。

綜上所述，赤芍總苷能夠明顯降低慢性盆腔炎大鼠子宮組織炎性水平，并提高抗炎性因子水平，改善子宮組織病理變化，其機制可能與調節(jié)NF-κB通路有關。