伍蘭萼 章青青 郭倩 熊衛(wèi)標(biāo)

近年來，全球心血管疾病的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)[1]。血管重構(gòu)是多種心血管疾病的病理基礎(chǔ)。先前關(guān)于血管重構(gòu)的研究主要集中在血管內(nèi)膜和中膜的功能上，包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[2]。最近越來越多的研究關(guān)注外膜的作用，外膜成纖維細(xì)胞(adventitial fibroblasts，AFs)是外膜中的主要細(xì)胞類型[3,4]。研究表明，AFs參與炎性反應(yīng)、血管重塑和再狹窄[5]。AFs增殖和凋亡的平衡對(duì)于脈管系統(tǒng)的生理至關(guān)重要[6]。益母草堿是從唇形科植物益母草中提取的有效化合物成分，已被證實(shí)具有抗腫瘤和心臟保護(hù)的潛力，對(duì)急性心肌缺血和心肌缺血再灌注的心肌具有保護(hù)作用[7,8]。有研究顯示，益母草堿能夠抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞增殖活力[9]。目前尚無關(guān)于益母草堿對(duì)AFs作用的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探究益母草堿對(duì)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞(human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)增殖和凋亡的影響，并探究其作用機(jī)制，以期為益母草堿用于心血管疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦血管外膜成纖維細(xì)胞株(HBVAFs)購于美國ScienCell公司；益母草堿、MTT試劑、二甲基亞砜(DMSO)和NF-κB信號(hào)通路激活劑佛波酯(PMA)購于美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國HyClone公司；AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒購于美國BD公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和SDS-PAGE凝膠試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司；NF-κB p65單抗、IKK-α單抗和IKK-β單抗購于美國CST公司；IgG二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 HBVAFs培養(yǎng) 取出凍存的HBVAFs，復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液(含1%青霉素-鏈霉素雙抗)重懸并培養(yǎng)，放置在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長匯合至90%左右時(shí)加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集分裝進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用第3代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)益母草堿對(duì)HBVAFs增殖活力的影響 對(duì)數(shù)期的HBVAFs接種到96孔板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼壁生長后，用不同濃度(0、5、10、15、20 μmol/L)的益母草堿干預(yù)細(xì)胞，其中對(duì)照組為0 μmol/L的益母草堿，空白組只加DMEM高糖培養(yǎng)基不加細(xì)胞，各組細(xì)胞處理48 h后，每孔細(xì)胞依次加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出96孔板，吸去細(xì)胞上清液，每孔細(xì)胞依次加入DMSO 150 μl，振蕩反應(yīng)直至結(jié)晶物充分溶解。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞的吸光度值(A值)，檢測(cè)波長為450 nm，分別計(jì)算各個(gè)濃度的益母草堿對(duì)HBVAFs增殖能力的影響，細(xì)胞增殖率(%)=(藥物組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。采用GraphPad Prism 7.0軟件計(jì)算益母草堿干預(yù)HBVAFs 48 h半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4 HBVAFs分組和處理 對(duì)數(shù)期的HBVAFs接種到6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為Control組、Leonurine組和Leo+PMA組。其中Control組HBVAFs不加任何處理，Leonurine組HBVAFs以10 μmol/L益母草堿干預(yù)48 h，Leo+PMA組HBVAFs以10 μmol/L益母草堿和1 μmol/L NF-κB信號(hào)通路激活劑佛波酯PMA干預(yù)48 h。3組HBVAFs處理后收集細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBVAFs克隆形成能力 用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并種植到6孔板中，每孔種植1×103個(gè)，吹打細(xì)胞至細(xì)胞均勻分散，將6孔板放置在常規(guī)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，14 d左右出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)，以甲醇固定細(xì)胞，以結(jié)晶紫染色，洗去染色，晾干后放置在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)≥50個(gè)的細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞克隆形成率，克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 對(duì)數(shù)期的HBVAFs以3×105個(gè)接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后按照上述1.4法分組和處理，48 h后以胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，以PBS洗滌細(xì)胞，以預(yù)冷的70%的乙醇固定細(xì)胞24 h，除去乙醇，PBS洗滌細(xì)胞，加入含Rnase A的PI染液，避光染色30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Modfit軟件分析各周期細(xì)胞比例。

1.7 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 對(duì)數(shù)期的HBVAFs以1×105個(gè)/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h，除去原培養(yǎng)液，以1.4方法分組和處理，48 h后常規(guī)收集細(xì)胞，以PBS洗滌細(xì)胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說明分別加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液，混勻后室溫下避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組HBVAFs凋亡情況。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表達(dá) HBVAFs按照1.4方法分組和處理48 h，收集3組細(xì)胞，分別加入適量細(xì)胞裂解液，于冰上抽提總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性后行SDS-PAGE電泳，蛋白樣品分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封阻2 h，孵育一抗NF-κB p65(1∶800稀釋)、IKK-α(1∶800稀釋)和IKK-β(1∶800稀釋)，4℃過夜，孵育二抗(1∶3 000稀釋)2 h，以ECL進(jìn)行顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-actin為內(nèi)參，分析各組細(xì)胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 益母草堿對(duì)HBVAFs增殖活力的影響 隨著益母草堿濃度的升高，HBVAFs增殖率呈明顯的濃度依賴性，益母草堿對(duì)HBVAFs的IC50為12.55 μmol/L，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10 μmol/L為加藥濃度。見表1。

表1 不同濃度的益母草堿對(duì)HBVAFs增殖活力的影響

2.2 3組HBVAFs克隆形成率比較 與Control組比較，Leonurine組克隆形成率明顯降低(P<0.05)，與Leonurine組比較，Leo+PMA組克隆形成率明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 3組HBVAFs克隆形成率比較

2.3 3組HBVAFs細(xì)胞周期進(jìn)程比較 與Control組比較，Leonurine組G2/M期細(xì)胞比例明顯增多(P<0.05)；與Leonurine組比較，Leo+PMA組G2/M期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)，G1期和S期細(xì)胞比例組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組HBVAFs細(xì)胞周期進(jìn)程比較

2.4 3組HBVAFs凋亡率比較 與Control組比較，Leonurine組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與Leonurine組比較，Leo+PMA組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 Annexin V-FITC/PI雙染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBVAFs凋亡率

表4 3組HBVAFs凋亡率比較

2.5 3組NF-κB p65、IKK-α和IKK-β表達(dá)水平比較 與Control組比較，Leonurine組細(xì)胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，與Leonurine組比較，Leo+PMA組NF-κB p65、IKK-α和IKK-β蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表達(dá)

表5 3組HBVAFs中NF-κB p65、IKK-α和IKK-β表達(dá)水平比較

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，外膜細(xì)胞在血管重塑中起重要作用[10]。在諸如損傷和細(xì)胞因子之類的病理刺激下，外膜中的主要細(xì)胞類型(AFs)被激活并發(fā)生表型變化，包括增殖和分化為肌成纖維細(xì)胞。當(dāng)肌成纖維細(xì)胞的生命周期調(diào)節(jié)不當(dāng)時(shí)，細(xì)胞凋亡的缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積的過度產(chǎn)生和病理性血管重塑。此外，這些過程伴隨著外膜細(xì)胞向內(nèi)腔的遷移，從而促進(jìn)了新內(nèi)膜的形成[11]。不受控制的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的抑制是血管重構(gòu)中的關(guān)鍵細(xì)胞事件[12]。因此，調(diào)控外膜成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡在血管重塑中發(fā)揮重要作用，在多種心血管疾病的防治中扮演重要角色。傳統(tǒng)中藥如益母草、黃芪、鉤藤等在用于臨床治療心血管疾病中效果顯著[13]。益母草堿是臨床上常用藥物益母草的主要藥效成分，其具有抗炎、抗細(xì)胞纖維化、保護(hù)心肌、改善神經(jīng)功能等多種生物學(xué)功能[14,15]。目前研究指出，益母草堿是一類治療心腦血管新藥的候選藥物[16]。然而，益母草堿對(duì)HBVAFs的影響尚無報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)參考以往文獻(xiàn)[17]和前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇不同濃度的益母草堿干預(yù)HBVAFs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益母草堿能夠呈濃度依賴性的抑制HBVAFs增殖活力。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以接近益母草堿干預(yù)HBVAFs的IC50為加藥濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益母草堿能夠抑制HBVAFs的克隆形成，阻滯細(xì)胞周期至G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明益母草堿能夠抑制HBVAFs增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

NF-κB信號(hào)通路是一種廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，具有多種調(diào)節(jié)作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病與NF-κB信號(hào)通路的異常激活密切相關(guān)[19,20]。NF-κB信號(hào)通路在心室重構(gòu)、心肌細(xì)胞生理病理變化中的作用至關(guān)重要[21]。NF-κB與抑制蛋白IκB相互結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，此時(shí)NF-κB處于失活狀態(tài)無調(diào)控活性。IKK-α和IKK-β是IκB激酶(IKK)復(fù)合物的亞基，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激后，IKK-α被降解，IKK復(fù)合物被激活釋放NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮調(diào)控作用[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PMA可上調(diào)NF-κB p65、IKK-α和IKK-β的表達(dá)，且能夠逆轉(zhuǎn)益母草堿對(duì)HBVAFs增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)的作用，證實(shí)了益母草堿抑制HBVAFs增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡與NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益母草堿能夠抑制HBVAFs增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路的激活有關(guān)。