馬亞軍 吳寶恩 任可一 高秋芳 蘭阿峰

瘢痕疙瘩常生長(zhǎng)于正常皮膚上擴(kuò)張超過原始傷口的邊緣，并伴有疼痛、畸形等癥狀，瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)率高且術(shù)后畸形偏多，因而急需研發(fā)新型治療方法[1,2]。miRNA可參與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程[3,4]。miR-338-5p通過靶向FERMT2抑制食道鱗狀細(xì)胞的細(xì)胞增殖、集落形成及遷移[5]。但miR-338-5p對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未闡明。Targetscan7.2預(yù)測(cè)顯示miR-338-5p與TRPC1存在結(jié)合位點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)TRPC1在結(jié)腸癌中表達(dá)水平升高，并可能參與結(jié)腸癌發(fā)生過程[6]。但miR-338-5p是否可調(diào)控TRPC1表達(dá)而影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖以及膠原合成尚未可知。因此，本研究主要探討瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-338-5p與TRPC1的表達(dá)及其對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 收集2018年3月至2019年5月于本院皮膚科、眼耳鼻喉科、普外科體表皮膚瘢痕疙瘩30例患者的瘢痕疙瘩標(biāo)本，同時(shí)收集30例皮脂腺囊腫周邊的正常皮膚組織，參照文獻(xiàn)[7]分離培養(yǎng)正常皮膚成纖維細(xì)胞NFB與人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞KFB。Lipofectamine2000試劑、Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄與SYBR Green試劑購(gòu)自北京天根生化；miR-NC、miR-338-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-338-5p購(gòu)自廣州銳博生物；pcDNA購(gòu)自上海吉瑪制藥；MTT試劑購(gòu)自北京索萊寶；兔抗人TRPC1抗體購(gòu)自武漢艾美捷；兔抗人CyclinD1購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；兔抗人Col-Ⅰ、Col-Ⅲ抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech；二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KFB細(xì)胞(2.5×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，miR-NC、miR-338-5p mimics、pcDNA-NC、pcDNA-TRPC1、miR-338-5p mimics與pcDNA-NC、miR-338-5p mimics與pcDNA-TRPC1轉(zhuǎn)染入KFB細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，分別記為miR-NC組、miR-338-5p組、pcDNA-NC組、pcDNA-TRPC1組、miR-338-5p+pcDNA-NC組、miR-338-5p+pcDNA-TRPC1組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的KFB細(xì)胞作為NC組。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-338-5p、TRPC1 mRNA的表達(dá)水平:采用Trizol法提取NFB、KFB細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后的各組KFB細(xì)胞總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增體系按照試劑盒說(shuō)明書操作，應(yīng)用美國(guó)ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-338-5p、TRPC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集各組KFB細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，每孔加入20 μl MTT溶液，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫避光孵育5 min后應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A值)。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-338-5p與TRPC1的靶向關(guān)系:Targetscan7.2預(yù)測(cè)顯示miR-338-5p與TRPC1存在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型載體TRPC1-3’UTR-WT、突變型載體TRPC1-3’UTR-MUT，miR-NC、miR-338-5p mimics分別與TRPC1-3’UTR-WT、TRPC1-3’UTR-MUT共轉(zhuǎn)染入KFB細(xì)胞，將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞并檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.5 Western blot檢測(cè)TRPC1、CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá):收集NFB、KFB細(xì)胞與轉(zhuǎn)染后各組KFB細(xì)胞加入400 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，將5×SDS上樣緩沖液加入其中后置于沸水中煮10 min，蛋白變性，取40 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋比的一抗與內(nèi)參一抗(1∶1 000)，加入1∶5 000稀釋比的二抗，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中，miR-338-5p、TRPC1的表達(dá)情況 與NFB細(xì)胞比較，KFB細(xì)胞中miR-338-5p的表達(dá)水平降低(P<0.05)，TRPC1 mRNA及蛋白水平升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測(cè)TRPC1

表1 人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中 miR-338-5p和TRPC1表達(dá)量

2.2 高表達(dá)miR-338-5p抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成 與miR-NC組比較，miR-338-5p組細(xì)胞活力降低(P<0.05)，CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白水平降低(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 低表達(dá)miR-338-5p對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖2 Western Blot檢測(cè)CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)

2.3 高表達(dá)TRPC1促進(jìn)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-TRPC1組細(xì)胞活力升高(P<0.05)，CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白水平升高(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 Western Blot檢測(cè)TRPC1、CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)

表3 高表達(dá)TRPC1促進(jìn)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成

2.4 miR-338-5p靶向TRPC1 Targetscan7.2預(yù)測(cè)顯示miR-338-5p與TRPC1存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-338-5p過表達(dá)可降低野生型載體TRPC1-3’UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)突變型載體TRPC1-3’UTR-MUT的熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)。與miR-NC組比較，miR-338-5p組TRPC1蛋白水平降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-338-5p組TRPC1蛋白水平升高(P<0.05)。見表4、5，圖4。

表4 miR-NC或miR-338-5p與TRPC1-3’UTR野生型及突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)

表5 Western Blot檢測(cè)TRPC1 的表達(dá)

圖4 miR-338-5p靶向TRPC1;A Targetscan7.2對(duì)TRPC1和miR-338-5p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖;B Western Blot檢測(cè)TRPC1蛋白的表達(dá)

2.5 高表達(dá)TRPC1可以逆轉(zhuǎn)miR-338-5p高表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的抑制作用 與miR-338-5p+pcDNA-NC組比較，miR-338-5p+pcDNA-TRPC1組細(xì)胞活力升高(P<0.05)，CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白水平升高(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 Western Blot檢測(cè)TRPC1、CyclinD1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)

表6 高表達(dá)TRPC1可以逆轉(zhuǎn)miR-338-5p高表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的抑制作用

3 討論

研究證實(shí)，miRNA在瘢痕疙瘩中表達(dá)異常并可參與瘢痕疙瘩的發(fā)生及發(fā)展過程，還可能作為瘢痕疙瘩潛在的治療靶標(biāo)，例如，miR-21通過靶向FasL，通過caspase-8和線粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的凋亡[8]。miR-181a靶向PHLPP2以增強(qiáng)AKT信號(hào)傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡[9]。miR-152-5p通過調(diào)節(jié)Smad3的表達(dá)而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和遷移并促進(jìn)凋亡[10]。但仍有部分miRNA在瘢痕疙瘩形成過程中的作用機(jī)制尚未闡明。

miR-338-5p通過靶向ADAMTS-9而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。miR-338-5p通過直接靶向EFEMP1抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)其凋亡[12]。但miR-338-5p在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果提示miR-338-5p在瘢痕疙瘩形成過程中可能發(fā)揮調(diào)控作用，miR-338-5p過表達(dá)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖。Col-Ⅰ、Col-Ⅲ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)可有效減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[13,14]。本研究結(jié)果顯示miR-338-5p過表達(dá)可能通過抑制膠原蛋白合成從而抑制瘢痕疙瘩的形成。

本研究證實(shí)miR-338-5p可靶向結(jié)合TRPC1，并可負(fù)向調(diào)控TRPC1的表達(dá)。TRPC1/3/6抑制通過Ras/Raf1/ERK信號(hào)通路減弱TGF-β1誘導(dǎo)的胃癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。TRPC1在多發(fā)性骨髓瘤、嬰兒血管瘤等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可能參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程[16,17]。本研究結(jié)果提示TRPC1過表達(dá)可促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖以及膠原合成。同時(shí)本研究采用miR-338-5p過表達(dá)與TRPC1過表達(dá)聯(lián)合處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，結(jié)果提示TRPC1過表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)miR-338-5p過表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖以及膠原合成的作用。

綜上所述，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-338-5p的表達(dá)水平降低，而TRPC1的表達(dá)水平升高，miR-338-5p過表達(dá)可通過下調(diào)TRPC1表達(dá)而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及膠原蛋白合成從而抑制瘢痕疙瘩的形成，可為進(jìn)一步揭示瘢痕疙瘩形成的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，miR-338-5p/TRPC1還可能作為瘢痕疙瘩治療的潛在靶標(biāo)。