王麗喆 王 英 談 飛 李 雪 王少磊 夏曉敏 劉 杰

骨組織工程旨在為創(chuàng)傷、感染、腫瘤或其他原因造成的骨缺損提供安全、有效、微創(chuàng)的骨組織修復方案［1，2］。與傳統(tǒng)的自體骨移植和異體骨移植相比，可注射組織材料操作簡單、對宿主損傷小且費用低，具有廣闊的應用前景［3，4］。近年來可注射水凝膠已廣泛應用于生物醫(yī)學，例如作為骨組織工程、生物傳感和藥物傳遞技術以及細胞固定的支架［5］。藻酸鹽水凝膠因其具有良好的生物相容性、能夠模擬天然細胞微環(huán)境、可塑性強且能夠在體內(nèi)安全降解，被視為理想的骨修復生物材料之一［6］。在多數(shù)研究中，鈣離子常被選擇為藻酸鹽水凝膠的交聯(lián)劑，但單純的藻酸鈣水凝膠由于其高度親水性使得細胞黏附困難，同時缺乏誘導骨細胞增殖以及成骨分化的作用［7］。鎂是人體內(nèi)含量占第四的礦物元素，其一半的含量存在于骨骼中，研究表明鎂離子參與成骨細胞的連接與分化，加速礦化過程以促進骨骼的發(fā)育和愈合，同時具有促進細胞黏附、增殖的作用［8-11］。

生物可吸收高分子微球逐漸被用作治療組織缺陷的生物材料，得益于它們填充不規(guī)則形狀缺陷的能力和微創(chuàng)操作的優(yōu)勢。乳酸-羥基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA）由于優(yōu)異的降解性、生物相容性、低免疫原性和低毒性而廣泛應用于骨組織工程，已經(jīng)被美國食品與藥品管理局批準可用于藥物控釋的載體［12］。本實驗即采用乳化法制備載有鎂的PLGA（PMg）微球，旨在將微球添加到藻酸鹽水凝膠中形成微球凝膠復合體，使鎂離子能夠均勻、穩(wěn)定地釋放，并發(fā)揮其增強細胞黏附、增殖的作用，同時改善凝膠的理化性能。

1.材料與方法

1.1 主要材料和試劑 海藻酸鈉粉末（Sigma，美 國）；PLGA（Aladdin， 中 國）；氧 化 鎂 粉 末（Aladdin， 中國）；碳酸鎂粉末（Aladdin， 中國）；二氯甲烷（Aladdin， 中國）；吐溫-60（國藥，中國）；司班-80（Aladdin， 中國）；聚乙烯醇1788（Aladdin， 中國）；分析純CaCl2（上海源葉生物科技有限公司）；活死細胞染色檢測試劑盒（大連美侖生物技術有限公司）；溶菌酶（索萊寶，中國）；磷酸鹽緩沖液（大連美侖生物技術有限公司）；CCK-8試劑盒（ 大連美侖生物技術有限公司）；MC3T3-E1 subclone14 小鼠前成骨細胞（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）。

1.2 實驗主要設備 掃描電鏡（Nova 公司，德國）；熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；ICP-OES optima8000（PerkinElmer 公 司，美 國）；0.001 g精度電子天平（setra，美國）；磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，中國）；多功能酶標儀（Tecan Safire2，瑞士）。

1.3 負載MgO和MgCO3的PLGA（PMg）微球制備 將0.5 g PLGA溶于10 mL二氯甲烷中，渦旋振蕩以保證完全溶解，向其中加入1 mL 1%的司班-80、0.125 g MgO 和0.125 g MgCO3，均質(zhì)（18000 rpm）后得到懸浮液。向100 mL 1%的聚乙烯醇（PVA）溶液中加入1 mL 10%的吐溫-60溶液，用磁力攪拌器將二者混勻。將獲得的MgO和MgCO3懸浮液緩慢滴入到配置好的PVA溶液中，使用機械攪拌并置于通風櫥內(nèi)揮發(fā)固化成球。使用去離子水將微球洗滌三遍，凍干后收集備用。

1.4 PMg-藻酸鹽凝膠復合體的制備 以磷酸鹽緩沖液（PBS）作為溶劑，配置最終濃度為3% wt的海藻酸鈉溶液；以雙蒸水為溶劑，配置最終濃度為5 g/L的氯化鈣溶液，將其與配置好的等量海藻酸鈉溶液混合，使用特定模具制成直徑為1 cm 的凝膠圓盤，命名為A 組（對照組）；分別稱取PMg 微球 3 mg、9 mg、15 mg 和21 mg，均 勻 分 散 于3mL 配置好的氯化鈣溶液中，形成平均密度ρ 為1×10-3kg/m3、3×10-3kg/m3、5×10-3kg/m3、7×10-3kg/m3的懸濁液，同樣與等量的海藻酸鈉溶液混合，使用特定模具制成直徑為1 cm 的凝膠圓盤，命名為B、C、D、E組（實驗組）。

1.5 表面形貌觀察及元素分析 將PMg 微球、凝膠樣本均勻粘在導電膠上，使用噴金儀均勻噴涂一層鉑金，用SEM 觀察微球的表面形貌。任意選取視野中微球表面3個點，用X 射線光電子能譜分析儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）進行電子能譜分析，確定其表面化學組成。

1.6 凝膠樣本中Mg2+析出濃度檢測 稱量3 mg PMg微球分散于9 mL 37℃的α-MEM培養(yǎng)基中；另將各組凝膠樣本（n=5）完全浸入1 mL 37℃培養(yǎng)基中，在浸泡后第1、3、5、7、14、21天的同一時間分別收集微球及各組凝膠的浸泡液，利用電感耦合等離子體光譜儀（ICP-OES optima8000）測定浸泡液中Mg2+濃度，記錄數(shù)據(jù)。

1.7 凝膠樣本溶脹率檢測 將制備好的各組凝膠樣本（n=4）分別于PBS和雙蒸水中充分溶脹24 h后，測量濕重W1及干重W2，按照以下公式計算溶脹率：（W1—W2）/W2，每組計算后取均值。

1.8 凝膠樣本降解率檢測 制備凝膠樣本（n=4），稱量其初始重量記為W0并將其置于24孔板內(nèi)；向每孔加入1 mL 0.5 mg/L的溶菌酶溶液， 每24 h更換一次溶菌酶溶液，在浸泡的第1、3、5、7、14、21天分別取出樣本稱重，記為W1。支架剩余質(zhì)量分數(shù)（w）計算公式：w(%)=W1/W0×100%。

1.9 細胞培養(yǎng)及接種 以MC3T3-E1 細胞株作為本實驗的種子細胞，當生長密度超過80%時，用胰蛋白酶消化，離心，棄上清液，加入含有10%胎牛血清、5%青霉素鏈霉素的完全培養(yǎng)基4 mL，分至兩個培養(yǎng)瓶中，補培養(yǎng)基至4 mL，常規(guī)置37℃，5%CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)兩代后收集細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后吹打均勻，調(diào)整細胞懸液密度至5×106個/L，在24孔板內(nèi)每孔加入60 uL，后添加培養(yǎng)基至1 mL。

1.10 細胞黏附形態(tài)的掃描電鏡觀察MC3T3-E1細胞于凝膠樣本表面接種18 h后，將樣品置于戊二醛固定液中固定，脫水干燥，用掃描電鏡觀察。

1.11 細胞黏附率的檢測 將調(diào)整后的細胞密度為5×106個/L的細胞懸液分別接種于3個批次的24孔板中，分別標記2 h、6 h和18 h，均放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于培養(yǎng)后2 h、6 h、18 h時取出，消化離心后吹打制成細胞懸液。使用細胞計數(shù)板分別對三個批次的每組細胞進行計數(shù)，計算黏附率。細胞黏附率（%）=已貼壁細胞數(shù)/接種細胞總數(shù)×100%。

1.12 活/死細胞染色觀察 將接種后的MC3T3-E1細胞分別于第1、3、5天采用AM/PI染色，觀察細胞在凝膠表面的增殖活性。在倒置熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)波長時觀察活細胞（黃綠色熒光）和死細胞（紅色熒光）。

1.13 CCK-8 法檢測細胞毒性及增殖活性 在MC3T3-E1 細胞接種后的第1、3、5 天，以10∶1 的比例將CCK-8試劑滴加到接種種子細胞的凝膠復合體的培養(yǎng)基中，將孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h后取出，吸取100μL孔板中的培養(yǎng)基與CCK-8 混合液至96 孔板，450 nm 波長下測吸光度值OD450。細胞毒性實驗僅計算第1 天的細胞相對存活率，細胞相對存活率＝［(實驗孔OD值-空白孔OD 值)/(對照孔OD 值-空白孔OD值)］×100%。

2.結果

2.1 表面形貌觀察及元素分析 使用SEM在2000倍下觀察微球形貌，可見微球表面呈多孔狀，孔隙大小不均，微球直徑大小在20-60μm之間。對PMg微球表面進行EDS元素分析，如圖1所示，鎂元素被成功添加到微球中，其原子數(shù)百分含量為9.76%，質(zhì)量百分比為16.35%。

圖1 PMg微球微觀形貌及其表面元素分析結果

在100 倍鏡下觀察各組水凝膠樣本，如圖2 所示，均呈現(xiàn)多孔隙的三維海綿狀結構。其中C、D、E組PMg-藻酸鹽凝膠復合體可見明顯的、數(shù)量較多的PMg 微球粘連在水凝膠的內(nèi)部結構中。在各組樣本中，A 組水凝膠孔隙直徑較大，整體結構較為疏松，孔徑約為500μm；而隨著微球數(shù)量的增加，PMg-藻酸鹽凝膠復合體逐漸呈現(xiàn)出更加密集的結構。

圖2 各組凝膠樣本微觀形貌A：單純Ca2+藻酸鹽凝膠；B：平均密度為1×10-3 kg/m3的PMg-藻酸鹽凝膠復合體；C：平均密度為3×10-3 kg/m3的PMg-藻酸鹽凝膠復合體；D：平均密度為5×10-3 kg/m3的PMg-藻酸鹽凝膠復合體；E：平均密度為7×10-3 kg/m3的PMg-藻酸鹽凝膠復合體

2.2 ICP-EOS 檢測凝膠及PMg 微Mg2+析出濃度 單純的PMg 微球在溶液中的Mg2+存在突釋現(xiàn)象，在浸泡的第1天時釋放量最多，第3天釋放量明顯下降，7 天后釋放趨勢明顯緩和（圖3A）。而PMg-藻酸鹽凝膠復合體中Mg2+的釋放量在7 天之內(nèi)較為平均，隨著時間的推移，各組PMg-藻酸鹽凝膠復合體釋放到溶液中的Mg2+的濃度無明顯上升或下降，其釋放趨勢較為穩(wěn)定；7 天后至第21天，其釋放濃度開始降低。4 組實驗組中的Mg2+析出濃度均隨著微球量的增加而增大（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 A：不同時間點PMg微球浸泡液中Mg2+的析出濃度；B：不同時間點PMg-藻酸鹽凝膠復合體浸泡液中Mg2+的析出濃度

2.3 凝膠溶脹率檢測 表1展示出各組凝膠分別在ddH2O和PBS中溶脹率的變化。結果表明，在藻酸鈣水凝膠中加入PMg微球，能夠使凝膠的溶脹率增大，且與對照組相比，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；但各個實驗組之間的溶脹率數(shù)值沒有統(tǒng)計學差異。

表1 各組凝膠樣本的溶脹率檢測（±s）

表1 各組凝膠樣本的溶脹率檢測（±s）

*表示與A組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）

PBS 36.60±1.84 42.48±1.41*43.59±4.53*44.76±4.53*44.27±2.47*組別ABCDE ddH2O 54.75±2.19 63.20±1.64*64.52±3.43*64.71±5.81*66.76±4.37*

2.4 凝膠降解率檢測 如圖4 所示，隨著時間的推移，各組水凝膠的質(zhì)量均下降，21 天時E 組剩余質(zhì)量最多，為初始質(zhì)量的45.46%；而A 組剩余質(zhì)量最少，僅為初始質(zhì)量的15.78%。隨著微球含量的增加，PMg-藻酸鹽凝膠復合體的降解率逐漸減緩，其中第1 天B、C、D、E 組與對照組之間均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），第3 天C、D、E 組與對照組之間有統(tǒng)計學差異；第7 天以后至第21 天，僅D、E 組與對照組之間有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

圖4 各組凝膠在不同時間點的降解率

2.5 凝膠表面細胞的毒性檢測 細胞毒性實驗顯示，細胞接種1 天后，對照組的細胞相對存活率歸一化處理為100%，各實驗組的細胞相對存活率與對照組相比無差異（圖5），說明本實驗所使用的PMg-藻酸鹽凝膠復合體生物相容性良好，可用作后續(xù)的實驗研究。

圖5 細胞接種1d后，各組的細胞相對存活率

2.6 凝膠表面的細胞黏附形態(tài)觀察 在500 倍鏡下觀察凝膠表面的細胞發(fā)現(xiàn)，C、D 組伸展數(shù)量較多，其中C 組黏附情況較好，數(shù)量最多；A、E 組細胞黏附數(shù)量較少。在2000 倍鏡下觀察，B、C、D 組細胞個體伸展形態(tài)良好，有較多突出的紡錘狀偽足，且黏附面積更大；A組細胞尚可見伸展的偽足，而E組細胞大多呈球形，未觀察到較多伸展及有偽足的細胞（圖6）。

圖6 細胞接種18 h后，掃描電鏡觀察細胞黏附形態(tài)。a.A組，×500；b.A 組，×2000；c.B組，×500；d.B組，×2000；e.C 組，×500；f.C 組，×2000；g.D 組，×500；h.D 組，×2000；i.E 組，×500；j.E 組，×2000

2.7 凝膠表面細胞黏附率 如圖7所示，各組細胞黏附率呈時間依賴性增加；其中在18 h時C組細胞的黏附率顯示出最高，與A、B、E組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在2 h、6 h時B、C、D、E組隨著Mg2+濃度的增加，其黏附率相應升高（P＜0.05）。

圖7 細胞培養(yǎng)2 h、6 h、18 h時各組凝膠表面的黏附率。*表示與A組相比有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）

2.8 凝膠表面細胞的活/死熒光染色觀察A、B、C、D 4 組活細胞數(shù)量隨著時間的延長而增多，且黏附形態(tài)呈長梭形或多角形。細胞培養(yǎng)的第3天和第5 天，隨著Mg2+濃度的增加，B、C、D、E 組死細胞數(shù)量均不同程度上升，其中E 組死細胞數(shù)量占比最大，且細胞形態(tài)多呈球形，有偽足伸展的細胞數(shù)量較少（圖8）。

圖8 AM/PI活、死細胞染色圖，其中綠色為活細胞，紅色為死細胞。a、b、c分別為A 組接種MC3T3-E1細胞后第1、3、5天；d、e、f分別為B組接種MC3T3-E1細胞后第1、3、5天；g、h、i分別為C 組接種MC3T3-E1細胞第1、3、5天；j、k、l分別為D 組接種MC3T3-E1細胞第1、3、5天；m、n、o分別為E 組接種MC3T3-E1細胞第1、3、5天

2.9 凝膠表面細胞的增殖活性檢測 細胞增殖實驗顯示，隨著時間的延長，各組凝膠表面的細胞增殖活性逐漸上升（P＜0.05）。第1 天時各組之間的細胞增殖活性沒有明顯的差異；在第3 天和第5天時，隨著Mg2+濃度的升高，A、B、C、D 組細胞增殖行為明顯被促進，其中D 組表現(xiàn)出最高的增殖活性；而E組與D組相比，在第5天時其增殖活性明顯下降（P＜0.05）。

3.討論

藻酸鹽是一種來源于褐藻的線性、非支鏈共聚物，它可與Ca2+、Sr2+、Zn2+等二價陽離子交聯(lián)形成水凝膠［13］。藻酸鹽水凝膠通常使用Ca2+作為交聯(lián)劑，但藻酸鈣水凝膠極易與鈉離子發(fā)生置換而導致結構坍塌［14］。除此之外，藻酸鈣水凝膠具有高度的親水性，細胞難以黏附于其表面，而單純的Ca2+誘導骨細胞增殖及成骨分化的作用較弱，這些缺點限制了藻酸鹽水凝膠在骨組織工程中的應用與發(fā)展［15，16］。近年來不少研究報道證明，鎂能夠加速骨折愈合，促進骨組織的重建和再生［8，17］。Okawachi等人發(fā)現(xiàn)用氯化鎂對鈦表面進行水熱處理能夠增強Sa3上皮細胞和NIH3T3成纖維細胞的早期黏附［10］。本實驗前期預實驗對MgCO3和MgO 進行了不同濃度比例的篩檢，結果發(fā)現(xiàn)MgO 的比例越大，Mg2+的釋放速率就越快，被微球包埋的鎂元素會在很短的時間被釋放出來，而加入MgCO3后，突釋行為得到了有效的緩解。另外，Yuan 等人通過將不同比列的MgCO3和MgO 包埋入PLGA 微球，發(fā)現(xiàn)當MgCO3：MgO=1∶1時，PMg 微球的初期爆發(fā)釋放行為相對緩和［18］。因此本實驗將MgCO3和MgO 按1∶1包裹在PLGA 微球中，再將微球摻入凝膠，利用微球的緩釋功能使鎂能夠長效、穩(wěn)定地發(fā)揮其生物作用，促進MC3T3-E1 細胞的黏附、增殖，同時改善凝膠的理化性能，延緩其降解速率。

實驗結果表明，在藻酸鹽凝膠中添加PMg微球，使凝膠的內(nèi)部結構更加致密，增加了凝膠溶脹率的同時減緩了降解速率，并且微球添加量越多，Mg2+的釋放量隨之增加，凝膠的剩余質(zhì)量越多，其降解率呈現(xiàn)Mg2+劑量依賴性減緩，這可能是由于Mg2+從微球中釋放出來后與藻酸鹽結合成膠，彌補了凝膠中流失的一部分Ca2+從而延緩了凝膠的降解，這也解釋了為什么在凝膠中加入微球之后，Mg2+在單純微球浸泡液中的突釋現(xiàn)象得到了明顯改善。包裹了PMg微球的水凝膠由于其能夠與從微球中釋放出的Mg2+產(chǎn)生物理交聯(lián)，因此可充分減緩微環(huán)境中Mg2+濃度的上升速率，尤其在1、3、5、7天時，Mg2+的釋放尤為均勻、穩(wěn)定。實際上，在以往研究中也有類似的結果，例如Yuan等人發(fā)現(xiàn)PMg微球在浸泡7天時其鎂離子釋放百分比接近50%，7天后的釋放速率明顯減緩，這與我們的實驗結果一致［18］。因此我們可以推測第14、21天微球-凝膠復合體的釋放濃度減低是由于微球中的Mg2+大部分已經(jīng)釋放，且在其初期爆發(fā)釋放時其濃度被凝膠有效地緩沖。在Yuan等人的實驗結果中我們還可以得知，PMg微球在28天時依舊穩(wěn)定釋放，并未出現(xiàn)終末爆發(fā)釋放的現(xiàn)象。同樣的，Lin等人、Brown等人也做了有關PLGA微球包裹Mg2+的實驗，結果均未發(fā)現(xiàn)在材料降解的終末時間出現(xiàn)爆發(fā)釋放，這也充分證明了PLGA微球作為藥物載體具有降解穩(wěn)定性［19，20］。

由于鎂離子是擴散結合而不是強位點結合，因此與藻酸鹽之間并不會迅速成膠［21］。一般來說，鎂-藻酸鹽溶液的物理化學特性強烈地依賴于藻酸鹽的組成，特別是藻酸鹽主干中G嵌段與M 嵌段的比率［16］。Topuz 等人的研究證實了在鎂與藻酸鹽的反應過程中，藻酸鹽G 嵌段的含量越高，凝膠越易形成［21］。此外，許多研究表明，相對穩(wěn)定的凝膠溶脹可能為細胞黏附、擴散甚至成骨提供更加舒適的環(huán)境［22，23］。而在本研究中各實驗組之間的溶脹率無明顯差異，這可能與實驗組組間Mg2+濃度差值過小有關。在Yin 等人的研究中，Mg2+濃度差值在10倍時，凝膠溶脹率有明顯的差異［16］。

細胞實驗結果表明，各組凝膠釋放出的Mg2+濃度均在安全范圍之內(nèi)，各實驗組的黏附行為和增殖活性均高于對照組，說明所制備的PMg-藻酸鹽凝膠復合體具備良好的生物相容性，并且有效地促進了細胞在其表面的黏附和增殖。結合離子析出和細胞黏附實驗結果，A、B、C 組隨著Mg2+析出濃度的增加，細胞黏附率上升，而D、E 組Mg2+析出濃度繼續(xù)增大，在18 h 時所累積的濃度已經(jīng)不利于細胞的黏附?？梢?，Mg2+濃度對細胞的黏附行為有著重要的影響。此外，細胞與材料之間的黏附是一個復雜的過程，受到與材料相關的多重因素的影響，例如表面結構、潤濕性、電荷等［24，25］。有文獻報道，整合素能夠與配體結合隨后作用于某些細胞內(nèi)信號通路繼而影響細胞的黏附行為，因此作者推測，將載有鎂的微球添加到藻酸鹽凝膠中促進了細胞的粘附行為可能與Mg2+增強了整合素的表達有關［26，27］。另外，摻入的Mg2+可能增強了凝膠表面的硬度，研究表明，細胞更傾向在表面硬度較強的基質(zhì)上黏附并呈現(xiàn)出伸展的形態(tài)［23］。在細胞增殖實驗中，D 組表現(xiàn)出最佳的增殖活性，E 組在第5 天時與D 組相比其增殖活性明顯下降，說明在D 組濃度對細胞增殖效果最佳。

眾所周知，Mg2+在溶液中產(chǎn)生堿性環(huán)境，而PLGA 的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，二者在生理溫度下產(chǎn)生微量的乳酸鈣和乳酸鎂，它們的生成一方面在一定程度上緩沖了微環(huán)境中的PH 值，同時實際上體液循環(huán)也能夠大大減緩局部離子釋放造成的潛在電解質(zhì)及酸堿性等微環(huán)境的改變；另一方面在后期的細胞成骨分化及鈣鹽沉積的過程中起到了一定的促進作用，為PMg-藻酸鹽凝膠復合體在成骨方面的應用奠定了基礎［19，28］。

綜上，本實驗所制備的PMg-藻酸鹽凝膠復合體能有效地促進MC3T3-E1 細胞在其表面的黏附、增殖，其中平均密度為3×10-3kg/m3的C 組細胞黏附效果最佳，而平均密度5×10-3kg/m3的D組細胞增殖效果最佳；與此同時也改善了凝膠的降解速率，使Mg2+更加均勻、穩(wěn)定地釋放。另外，基于Mg2+在誘導成骨中的重要作用，這種新型PMg-藻酸鹽凝膠復合體可能對前成骨細胞后期的成骨與分化有著潛在影響，這些特征使得其成為骨組織工程中很有前景的支架材料。