黃 容，張 鍵，車 旭

(1.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)研究所 能量代謝與生殖研究中心，廣東 深圳 518055;2.國(guó)家癌癥中心 國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院 肝膽外科，廣東 深圳 518116)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝癌形式，是世界第三大致死性腫瘤，發(fā)病率持續(xù)上升[1]，肝切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高是影響其預(yù)后的主要危險(xiǎn)因素[2]。SLC4A10(solute carrier family 4 member 10)，又名NCBE，屬于SLC4家族成員，是從小鼠胰島素瘤細(xì)胞系MIN6的cDNA文庫(kù)中首次克隆得到的一個(gè)基因，該基因在垂體、睪丸、腎臟和回腸組織中低表達(dá)，在腦組織中高表達(dá)[3]，在外周神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)組織，如脈絡(luò)叢、硬腦膜和一些上皮細(xì)胞中也有表達(dá)[4]。SLC4A10在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)分布、生理學(xué)及病理學(xué)重要性已經(jīng)得到比較廣泛的研究與認(rèn)識(shí)，但在肝癌中的表達(dá)及生理學(xué)作用尚不清楚。

本研究利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析SLC4A10在肝癌與癌旁組織中的表達(dá)并進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過(guò)單因素和多因素Cox回歸，分析SLC4A10與肝癌患者生存預(yù)后的相關(guān)性，并構(gòu)建SLC4A10的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network, PPI)，進(jìn)行功能富集分析，闡明SLC4A10的潛在作用機(jī)制，為肝癌的早期診斷、治療和判斷預(yù)后提供新的依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

1.1.1 SLC4A10在肝癌中表達(dá)分析：從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載SLC4A10在374例肝癌和50例癌旁組織中的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)(fragments per kilobase per million, FKPM)，分析SLC4A10在肝癌組織與癌旁組織中的mRNA表達(dá)。

1.1.2SLC4A10在肝癌中的基因突變分析：通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析SLC4A10在肝癌中的基因突變情況。

1.1.3 Kaplan-Meier(K-M)生存曲線分析：生存分析使用R-survival包，從TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載SLC4A10在374例肝癌中的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)(FKPM)以及相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)，首先計(jì)算SLC4A10表達(dá)量最優(yōu)分界點(diǎn)，根據(jù)表達(dá)量分界點(diǎn)將樣本分為SLC4A10高表達(dá)組和低表達(dá)組，作K-M生存曲線圖。

1.1.4 單因素和多因素Cox回歸分析：從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載SLC4A10在374例肝癌中的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)，采用R-survival包建立mRNA表達(dá)量以及臨床病理特征與肝癌患者總生存期和無(wú)病生存期的單因素回歸模型，篩選出有顯著影響(P<0.05)的因素，進(jìn)行肝癌患者總生存期和無(wú)病生存期的多因素回歸分析。

1.1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)：利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(search tool for the retrival of interacting genes/protein, STRING, https://www.string-db.org/)預(yù)測(cè)與SLC4A10共調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因的蛋白互作關(guān)系，綜合得分大于0.4的相互作用被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用cytoscape進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.1.6 功能分析：下載STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到的與SLC4A10共調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org)對(duì)關(guān)鍵基因(hub gene)進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO)分類注釋。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系Huh7/HepG2(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；人肝癌細(xì)胞系HLE/SMMC7721、人正常肝細(xì)胞系LO2(ATCC公司)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)材料：DMEM高糖培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司)；青霉素-鏈霉素、Trizol、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific公司)；PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix(2×)(Applied Biosystems公司)；引物(北京擎科生物科技有限公司合成)。

1.2.3 檢測(cè)方法：HLE/SMMC7721/Huh7/LO2細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)，HepG2細(xì)胞使用MEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)。所有細(xì)胞于5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)。將肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞分別接種6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度接近80%時(shí)，用Trizol裂解細(xì)胞，提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)成cDNA，使用Bio-rad熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增步驟：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列為：SLC4A10正向序列：5′-GTACGC CATAGGGTCCATGAG-3′,SLC4A10反向序列：5′-G GAACGAACAATGGGAATCCT-3′；ACTB正向序列：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，ACTB反向序列：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。反應(yīng)結(jié)束后，以ACTB為內(nèi)參，利用公式2-△△Ct計(jì)算各基因表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SLC4A10在肝癌中的表達(dá)分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中374例肝癌組織與50例癌旁組織mRNA表達(dá)分析顯示，SLC4A10在肝癌中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.01)(圖1A)，在50例配對(duì)肝癌與癌旁組織中，SLC4A10在癌組織的mRNA表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)(圖1B)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SLC4A10在正常肝細(xì)胞系(LO2)中的表達(dá)顯著高于肝癌細(xì)胞系(SMMC7721、HepG2、HLE、Huh7)(圖1C)。基因突變分析發(fā)現(xiàn)，SLC4A10在肝癌中的突變率為7%，主要包括錯(cuò)義突變、擴(kuò)增突變和深度缺失(圖1D)。

A.transcriptional level of SLC4A10 expression in 374 HCC tissues and 50 normal tissues in TCGA cohort；B.change of SLC4A10 mRNA expression between paired tumor samples and adjacent normal tissues from TCGA LIHC(liver hepatocellular carcinoma)studies；C.mRNA expression of SLC4A10 in normal liver cell line and hepatocellular carcinoma cell line；D.alteration analysis of SLC4A10；*P<0.05, **P<0.01 compared with normal group；#P<0.001 compared with LO2 cells group

2.2 SLC4A10在肝癌中的表達(dá)與患者預(yù)后的分析

針對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中371例具有總體生存數(shù)據(jù)的肝癌患者，Kaplan-Meier(K-M)生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，SLC4A10高表達(dá)患者(n=133)的總體生存時(shí)間較SLC4A10低表達(dá)患者(n=238)更長(zhǎng)。在320例具有無(wú)病生存數(shù)據(jù)的肝癌患者中，相對(duì)于SLC4A10低表達(dá)患者(n=221)，SLC4A10高表達(dá)患者(n=99)的無(wú)病生存時(shí)間更長(zhǎng)(圖2)。

A.Kaplan-Meier survival curve comparing the overall survival(OS)time for different SLC4A10 expression subtypes in HCC patients from TCGA database；B.Kaplan-Meier survival curve comparing the disease free survival(DFS)time for different SLC4A10 expression subtypes in HCC patients from TCGA database

2.3 SLC4A10在肝癌中的表達(dá)與患者病理特征的Cox相關(guān)性分析

將374例肝癌患者臨床信息匯總(表1)，對(duì)患者臨床信息進(jìn)行Cox單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤M分期(P<0.05)，腫瘤T分期(P<0.001)，病理分級(jí)(P<0.001)和SLC4A10表達(dá)高低(P<0.01)顯著影響肝癌患者的總生存期，腫瘤M分期(P<0.01)，腫瘤T分期(P<0.001)，病理分級(jí)(P<0.001)和SLC4A10表達(dá)高低(P<0.01)顯著影響肝癌患者的無(wú)病生存期(表2)。用多因素Cox回歸模型計(jì)算腫瘤M分期，腫瘤T分期，病理分級(jí)和SLC4A10表達(dá)量的危險(xiǎn)度，發(fā)現(xiàn)SLC4A10低表達(dá)是肝癌患者不良預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表3)。

表1 肝癌患者臨床信息

表2 肝癌患者總生存期和無(wú)病生存期單因素Cox回歸分析

表3 肝癌患者總生存期和無(wú)病生存期多因素Cox回歸分析

2.4 構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)與功能注釋

SLC4A10的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與SLC4A10共表達(dá)的基因包括以下10個(gè):OSGEP，SLC12A2，SLC9A1，SLC9A5，AQP1，KCNH7，AHCYL1，SLC12A5，TMPRSS15，PDDC1(圖3A)，將以上11個(gè)具有相互作用的蛋白進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示，這些基因在鉀離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、單價(jià)無(wú)機(jī)陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)、頂端質(zhì)膜、細(xì)胞體積內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、溶質(zhì)-正離子聯(lián)合體和離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)等生物過(guò)程顯著富集(圖3B)。ClueGO功能注釋表明SLC4A10調(diào)控的生物過(guò)程包括跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞體積內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、鈉離子跨膜導(dǎo)入等生物過(guò)程(圖3C)。

A.the PPI network of SLC4A10 was constructed, a network of SLC4A10 and its co-expression genes was set up visually；B.functional enrichment analysis of a total of 11 involved genes were performed and visualized in barplot；C.functional annotation using ClueGO

3 討論

肝細(xì)胞癌是最常見的肝癌形式，是常見的惡性腫瘤之一，需要有對(duì)肝癌更為有效的診斷及預(yù)后判斷指標(biāo)。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，SLC4A10是一個(gè)肝癌低表達(dá)基因，SLC4A10表達(dá)是肝癌患者的總生存期和無(wú)病生存期的獨(dú)立預(yù)后因子，SLC4A10高表達(dá)患者對(duì)應(yīng)的生存預(yù)后更好，提示該指標(biāo)可作為一個(gè)潛在因子用于肝癌的診斷及預(yù)后的預(yù)測(cè)。

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與SLC4A10相互作用的蛋白主要富集于離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、維持細(xì)胞體積內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等生物過(guò)程。SLC4A10是SLC4家族中的一員，該家族蛋白介導(dǎo)了HCO3-、CO32-、Cl-、Na+、H+的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，參與pH調(diào)節(jié)、跨上皮H+/堿轉(zhuǎn)運(yùn)和離子穩(wěn)態(tài)等多種重要的生理過(guò)程[5]。SLC4家族包括10個(gè)成員，其中至少8個(gè)成員參與HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)。根據(jù)功能的不同，這8個(gè)成員可分為2大類，3個(gè)Cl-/HCO3-交換體(SLC4A1，SLC4A2，SLC4A3)，5個(gè)Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC4A4，SLC4A5，SLC4A7，SLC4A8，SLC4A10)，SLC4A4，SLC4A5屬于生電性，其余6個(gè)屬于電中性[6]。SLC4A11編碼一個(gè)鈉離子依賴的硼酸根轉(zhuǎn)運(yùn)體BTR1，SLC4A9的功能仍未確定[7]。這些SLC4家族成員都是整合膜蛋白，它們所編碼的膜蛋白都有著很相似的親水特征，但是轉(zhuǎn)運(yùn)活性存在顯著的差異，例如，Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠從膜的一側(cè)向其另一側(cè)運(yùn)輸Na+和HCO3-或其相關(guān)的物質(zhì)。SLC4A10屬于Na+/HCO3-電中性共轉(zhuǎn)運(yùn)體，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)尤其維持酸堿平衡，以及HCO3-跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于機(jī)體新陳代謝不斷產(chǎn)生酸性物質(zhì)，再加上HCO3-等弱酸或弱堿離子或者H+的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外pH一直處于不斷的變化之中，因此維持機(jī)體內(nèi)外的pH穩(wěn)態(tài)對(duì)于生物體各種功能的發(fā)揮至關(guān)重要，如中樞神經(jīng)元和心肌細(xì)胞的興奮性、心率產(chǎn)生、肌肉的伸縮、消化、受精[8]、細(xì)胞連接[9]、細(xì)胞構(gòu)型的改變[10]以及代謝酶的活性如磷酸果糖激酶[11]等。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌中SLC4A10表達(dá)降低，可能引起體內(nèi)酸堿環(huán)境失衡，引起代謝酶的活性改變，從而引起肝臟疾病的發(fā)生，最終導(dǎo)致惡性腫瘤的形成。

本研究分析發(fā)現(xiàn)SLC4A10是肝癌患者生存預(yù)后的潛在因子，可能通過(guò)改變體內(nèi)酸堿平衡引起腫瘤進(jìn)展，為進(jìn)一步研究SLC4A10在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了新的線索。