劉 偉，劉曉峰，趙寶輝

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院 骨科，河北 保定 071000)

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)[1-2]是一種來源于間充質(zhì)組織常見的惡性骨腫瘤，目前治療主要為手術(shù)聯(lián)合化療[3]，但其復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后仍很差，因此，迫切需要開發(fā)新的骨肉瘤治療靶點(diǎn)。TGF-α是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的配體，其與多種癌有關(guān)。在骨肉瘤組織中，TGF-α表達(dá)異常上調(diào)，并參與調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞增殖[4-5]，這表明TGF-α是一個對骨肉瘤生長及轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用癌基因。miRNA(microRNA)是一類內(nèi)源性ncRNA(non-coding RNA)，通過其轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。已經(jīng)證明骨肉瘤與多種miRNA相關(guān)，miRNA-708在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，并通過調(diào)控CUL4B參與骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[6]；癌相關(guān)成纖維細(xì)胞外泌體miR-1228能夠通過靶向SCAI促進(jìn)骨肉瘤的侵襲和遷移[7]。本研究前期已預(yù)測癌基因TGF-α有可能是miR-188潛在靶基因。雖已經(jīng)證實(shí)多種miRNA參與骨肉瘤的發(fā)展，但有關(guān)于miR-188暫無報(bào)道，本研究旨在觀察miR-188在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其對TGF-α的調(diào)節(jié)功能和對骨肉瘤細(xì)胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本、細(xì)胞和裸鼠：收集2018年5月至2020年5月于河北大學(xué)附屬醫(yī)院就診的經(jīng)手術(shù)切除的112例骨肉瘤手術(shù)患者腫瘤標(biāo)本及配對癌旁組織，所有術(shù)前均未進(jìn)行化學(xué)治療，本研究獲得河北大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(HDFY-LL-2021-016)且所有患者均已簽署知情同意書。人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心);BALB/c-nu小鼠(5～7周齡，雄性，體質(zhì)量15～19 g)，飼養(yǎng)于河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；PCR相關(guān)試劑、引物、檢測試劑盒和核蛋白提取試劑盒(Invitrogen公司)；熒光素酶試劑盒、熒光素酶載體和熒光素酶(Promega公司)；miR-188 mimic、miR-188抑制物和miR-NC(廣州銳博生物科技有限公司)；Western blot檢測試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MG63細(xì)胞。將MG63細(xì)胞分為陰性對照組(NC組)，miR-188組，TGF-α組，miR-188+TGF-α組；NC 抑制劑組，TGF-α siRNA組，miR-188抑制劑組，miR-188抑制劑+TGF-α siRNA組，轉(zhuǎn)染前24 h，接種到6孔板，待細(xì)胞增殖匯合度至70%～90%時，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-188的mRNA表達(dá)：使用Trizol從各組細(xì)胞中提取總RNA，按照RT-qPCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，U6作為miR-188的表達(dá)內(nèi)參，GAPDH作為TGFA的mRNA內(nèi)參。

1.2.3 Western blot檢測TGF-α的表達(dá)：提取組織蛋白，測定蛋白濃度，于12% SDS-PAGE分離蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉。加入TGF-α抗體，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入相應(yīng)二抗，ECL液暗室發(fā)光顯影和定影。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫預(yù)測：使用TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-188和TGF-α的結(jié)合位點(diǎn)(http://www.target scan.org/vert_71/)。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測熒光素酶活性：通過TargetScan發(fā)現(xiàn)miR-188在TGFA3′-UTR上的潛在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建TGFA野生型3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-TGFA-Wt和突變型報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-TGFA-Mut，將野生型或突變型報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-NC，miR-188 mimic，NC-抑制劑或miR-188抑制劑共轉(zhuǎn)染進(jìn)MG63細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.6 免疫組化檢測Ki-67和TGF-α的表達(dá)：組織切片置于65 ℃烤片，而后依次梯度脫蠟、水化、梯度脫蠟和水化。將切片置于檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中，進(jìn)行抗原修復(fù)。加入5%的正常羊血清封閉15 min。加入TGF-α抗體 或Ki-67抗體，4 ℃過夜。加入二抗，37 ℃孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木精室溫染色2 min，進(jìn)行脫水和中性樹脂封片，置于顯微鏡觀察切片。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測MG63細(xì)胞的遷移能力：將MG63細(xì)胞接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，用200 μL的移液器槍頭在正中位置劃一直線，形成單層細(xì)胞間的劃痕。利用PBS液將脫落的細(xì)胞沖洗掉。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8 構(gòu)建骨肉瘤裸鼠移植瘤模型：將裸鼠隨機(jī)分為miR-NC組，miR-188 mimic組，NC抑制劑組和miR-188抑制劑組，每組n=6。MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個/mL，用1 mL注射器將細(xì)胞懸液注射到裸鼠的右后肢腋部皮下，每只裸鼠接種細(xì)胞數(shù)為1×107個。注射后的裸鼠置于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，3周后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤，稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-188在骨肉瘤組織中表達(dá)變化和靶基因預(yù)測

相比癌旁組織，骨肉瘤組織中miR-188的表達(dá)明顯降低(圖1A)，miR-188在TGFA的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)及莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖1B)，轉(zhuǎn)染miR-188mimic明顯上調(diào)了MG63細(xì)胞中miR-188的表達(dá)，而miR-188 抑制劑則導(dǎo)致miR-188的表達(dá)明顯降低(圖1C)，pMIR-TGFA-Wt質(zhì)粒與miR-188 mimic共轉(zhuǎn)染進(jìn)MG63細(xì)胞時，熒光素酶活性明顯降低。而轉(zhuǎn)染miR-188抑制劑則能明顯增強(qiáng)pMIR-TGFA-Wt質(zhì)粒的熒光素酶活性(圖1D)。

A.expression of miR-188 in osteosarcoma and adjacent normal tissues were detected by RT-qPCR；B.targetscan predicted the potential binding site and stem loop structure of miR-188 on the 3′-UTR of TGFA；C.expression of miR-188 in MG63 cells was detected by RT-qPCR；D.luciferase activity was detected by double luciferase reporter gene assay in MG63 cells；*P<0.01 compared with control group

2.2 miR-188和TGF-α對MG63細(xì)胞遷移的影響

miR-188組細(xì)胞的遷移能力被抑制，而TGF-α組細(xì)胞遷移能力升高，miR-188+TGF-α組MG63細(xì)胞遷移能力較miR-188組明顯增強(qiáng)(圖 2A)；miR-188抑制劑較對照組細(xì)胞的遷移能力增加，miR-188抑制劑+TGF-α siRNA組較miR-188 抑制劑增殖能力降低(圖 2B)。

A.effects of mir-188 and TGF-α on the migration of MG63 cells；B.effects of miR-188 inhibitor and interfering TGF-α on MG63 cell migration；scale bar=25 μm；*P<0.01 compared with control group

2.3 miR-188在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型中的作用

miR-188mimic組裸鼠中Ki-67的表達(dá)明顯低于對照組，而miR-188抑制劑組中Ki-67的表達(dá)則明顯升高(圖 3)。

*P<0.01 compared with control group; scale bar=50 μm

2.4 在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型中TGF-α的表達(dá)

TGF-α蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)明顯升高(圖 4A，C)，RT-qPCR檢測骨肉瘤組織中TGF-α的mRNA表達(dá)，結(jié)果相同(圖 4B)。

A.expression of TGF-α in osteosarcoma tissues and adjacent normal tissues were detected by Immunohistochemistry; scale bar=50 μm；B.mRNA expression of TGF-α was detected by RT-qPCR; C.protein expression of TGF-α was detected by Western blot；*P<0.01 compared with normal group

3 討論

骨肉瘤侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，5年生存率很低[8-9]，揭示骨肉瘤致病因子和相關(guān)信號通路，對骨肉瘤進(jìn)一步診斷和治療至關(guān)重要。已證實(shí)miR-188在多種癌發(fā)揮抑癌作用。miR-188在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯下調(diào)，miR-188通過靶向β-catenin來抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[10]；通過表達(dá)miR-188-5p可以明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲并抑制體內(nèi)腫瘤生長[11]；在乳腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-188能夠抑制4T1和MCF-7細(xì)胞中增殖和遷移[12]。相似地，本研究也發(fā)現(xiàn)miR-188在骨肉瘤組織中的的表達(dá)明顯低于癌旁組織，提示miR-188可能在骨肉瘤中發(fā)揮抑癌作用。

已證實(shí)miRNA主要作用機(jī)制通過調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄后靶基因表達(dá)，參與腫瘤病理進(jìn)程，研究miRNA作用機(jī)制關(guān)鍵是揭示miRNA的靶基因[13]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-188在TGFA的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，且證實(shí)miR-188 mimic 能抑制TGFA野生型3′-UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性，而miR-188 抑制劑則產(chǎn)生相反效果，提示TGFA是miR-188的潛在靶基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤患者組織中，TGF-α表達(dá)明顯高于正常組織，這與既往研究結(jié)果類似。有報(bào)道TGF-α在骨肉瘤中組織和細(xì)胞中表達(dá)升高[14]；在非小細(xì)胞肺癌中，敲除TGFA將抑制NSCLC細(xì)胞增殖[15-16]。本研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道均證實(shí)癌基因TGF-α在骨肉瘤生長轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-188能抑制細(xì)胞的遷移能力，而上調(diào)TGF-α的表達(dá)則出現(xiàn)相反結(jié)果，同時miR-188抑制劑能促進(jìn)細(xì)胞的遷移能力，而干擾TGF-α的表達(dá)也會出現(xiàn)相反結(jié)果，并且miR-188對細(xì)胞的調(diào)控效果可被TGF-α逆轉(zhuǎn)，初步證實(shí)了miR-188是通過抑制TGF-α的表達(dá)從而調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移。從整體動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-188中Ki-67的表達(dá)均明顯低于對照組，而抑制miR-188后Ki-67的表達(dá)明顯高于對照組，表明miR-188在裸鼠體內(nèi)對骨肉瘤生長具有抑制作用，筆者還發(fā)現(xiàn)TGF-α在骨肉瘤裸鼠移植瘤模型組織中也呈現(xiàn)陽性信號。

綜上，本結(jié)果表明miR-188表達(dá)降低可能與骨肉瘤的進(jìn)展相關(guān)，進(jìn)一步揭示了TGFA是miR-188發(fā)揮調(diào)控作用的關(guān)鍵靶基因，提示miR-188通過抑制TGF-α在骨肉瘤的發(fā)揮作用。