王 帥，王建軍，孫秀紅，鄔鵬宇，崔志成，李占清

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 1.心臟血管外科；2.重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)，河北 唐山 063000)

心臟移植是終末期心臟病的首選治療方法，然而缺血/再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/RI)是臨床器官移植最常見的病理過程[1]，也是導(dǎo)致術(shù)后心功能不全和晚期并發(fā)癥的主要相關(guān)因素[1-2]。減輕 I/RI是改善移植心臟預(yù)后的關(guān)鍵途徑之一。

蘿卜硫素(sulforaphane)廣泛存在于十字科植物，在西蘭花中含量最多，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌及抗炎等藥理作用[3-6]。磷脂酰肌醇激酶-3/絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)信號(hào)通路能夠抑制細(xì)胞凋亡。有報(bào)道蘿卜硫素可激活PI3K/AKT信號(hào)通路，減輕腎臟細(xì)胞的 I/RI[7]。PI3K/AKT信號(hào)通路激活后能抑制糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的活性，進(jìn)而抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用。蘿卜硫素對(duì)心臟移植的保護(hù)作用，是否是通過激活PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路尚不清楚。本研究用大鼠異位異體心臟移植模型，檢測心肌細(xì)胞的損傷和細(xì)胞凋亡水平及PI3K/AKT信號(hào)通路在蘿卜硫素誘導(dǎo)的心肌保護(hù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑:康斯特保護(hù)液(HTK液)、Trizol、氯仿、異丙醇、乙醇和DEPC水(上海生工生物工程有限公司)；蘿卜硫素(格純生物有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)試劑盒和肌鈣蛋白T(troponin T,TnT)試劑盒(北京義翹神州生物)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；線粒體提取試劑盒和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)分析試劑盒(谷歌生物有限公司)；抗體分別為AKT、p-AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、tubulin(CST公司)。

1.1.2 動(dòng)物：32只SPF級(jí)雄性12周齡Wistar大鼠(上海斯萊克生物有限公司，合格證號(hào)滬：2020-0213)。

1.2 方法

1.2.1 同種異體活體心臟移植模型構(gòu)建：受體大鼠在移植前分為心臟移植組(對(duì)照組)和蘿卜硫素處理組(每組n=8)，蘿卜硫素處理組在移植前24 h經(jīng)鼠尾靜脈注射藥物2.5 mg/kg，對(duì)照組給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。將供心的主動(dòng)脈、主肺動(dòng)脈分別與受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈進(jìn)行端側(cè)吻合。放開動(dòng)脈夾即可見冠狀動(dòng)脈充血，10 s左右心臟復(fù)跳。所用的操作均在潔凈條件下操作，術(shù)后注意大鼠保溫，待大鼠清醒后，蘿卜硫素處理組經(jīng)鼠尾靜脈再次注射蘿卜硫素2.5 mg/kg，對(duì)照組給予同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 標(biāo)本的采集：采靜脈血，4 ℃ 2 500 r/min離心15 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中凍存。再灌注48 h后苯巴比妥鈉20 mg/kg麻醉大鼠，取出大鼠心臟用于形態(tài)學(xué)和分子水平的研究。

1.2.3 生存率的分析:大鼠隨機(jī)分為受體和供體，每組20只，所有供體心臟取出后于移植前冷藏于4 ℃ HTK液18 h，20只受體大鼠再次分為對(duì)照組和蘿卜硫素處理組，蘿卜硫素處理組的受體于移植前24 h經(jīng)尾靜脈注射蘿卜硫素2.5 mg/kg，對(duì)照組為等量的0.9%氯化鈉溶液，每天檢查移植心臟的跳動(dòng)，記錄大鼠存活日，使用Kaplan-Meier分析大鼠生存率。

1.2.4 心肌酶學(xué)的檢測：用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白T(TnT)的水平，判斷心肌的損傷程度。步驟詳見試劑盒說明書。

1.2.5 TUNEL染色檢測移植心肌細(xì)胞凋亡水平：取心臟組織約50 mg，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，然后切片，依次經(jīng)過脫蠟和水化，3% H2O2浸泡15 min后，加入TUNEL染液反應(yīng)30 min，PBS洗片最后加入DAB顯色液后，在顯微鏡下拍照，計(jì)算心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=染色陽性細(xì)胞/總細(xì)胞。

1.2.6 大鼠心肌細(xì)胞線粒體的提?。河貌钏匐x心法分離線粒體和胞質(zhì)成分，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.2.7 線粒體腫脹試驗(yàn)(mPTP開放試驗(yàn))：將新鮮線粒體懸浮于腫脹緩沖液中，包含(mmol/L)：KCl 120，Tris·HCl 10，KH2PO45，MOPS 20。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行線粒體濃度分析，調(diào)節(jié)線粒體終濃度達(dá)到0.5 mg/mL，并接種于96孔板中，加入氯化鈣誘導(dǎo)mPTP開放，利用520 nm吸光度(A)值評(píng)估線粒體腫脹程度。即讀取每分鐘吸光度(A)值，吸光度(A)值的差值/分鐘即為吸光度(A)值下降率。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA水平:加Trizol試劑振蕩碾磨提取心臟組織總RNA，加氯仿取出混懸液中的蛋白組織，加異丙醇沉淀總RNA，用75%乙醇洗滌總RNA白色沉，DEPC水溶解總RNA，測RNA濃度后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，最后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測基因的表達(dá)。

具體的引物序列如下：caspase-3 F:5′-ATCG ATCGATCGAGTCGGTAT-3′，R:5′-ATATATCGTGC ATGCTAGCGAT-3′；BaxF:5′-ATCTATCGATGCTGT GTAATATCCG-3′，R:5′-ACGCGCGCGCGTGTGTGT TAACCC-3′；β-actin F:5′-ATCGCGCGCGTATCGAT CGAT-3′，R:5′-ATCGCGCGCGACATTCGATTCC-3′。

1.2.9 Western blot檢測PI3K-AKT通路蛋白表達(dá)水平：RIPA緩沖液裂解心臟組織，離心取上清進(jìn)行蛋白濃度測定和SDS-PAGE。電泳結(jié)束后濾紙夾心法放入Bio-Rad濕轉(zhuǎn)裝置轉(zhuǎn)膜。加入一抗4 ℃孵育過夜，一抗結(jié)合完成后加入配二抗室溫結(jié)合2 h，加入ECL結(jié)合底物曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素對(duì)心臟移植大鼠生存率的影響

蘿卜硫素處理組的生存率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。

圖1 蘿卜硫素處理后同種異體心臟移植大鼠生存率

2.2 蘿卜硫素對(duì)心臟移植大鼠心肌酶的影響

蘿卜硫素處理組血清LDH、CK、CK-MB和TnT的濃度均低于對(duì)照組(P<0.05)(圖2)。

P<0.001 compared with control

2.3 蘿卜硫素對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

蘿卜硫素處理組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖3)。

A.TUNEL staining; B.apoptosis index of myocardial cell; <0.01 compared with control group

2.4 蘿卜硫素對(duì)心臟移植大鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

Caspase-3和Bax在蘿卜硫素處理組的基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖4)。

*P<0.01,**P<0.001 compared with control group

2.5 兩組大鼠心肌線粒體比較

對(duì)照組的線粒體吸光度(A)下降率顯著高于蘿卜硫素處理組[(45.45±8.68)vs(18.37±4.39),P<0.01]。

2.6 蘿卜硫素對(duì)心臟凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響

蘿卜硫素處理組受體大鼠心臟組織中PI3K/Akt/GSK-3β明顯被激活，AKT和GSK-3β的磷酸化水平明顯增加(P<0.01)，GSK-3β下游caspase-3的剪切水平降低(P<0.01)(圖5)。

A.Western blot; B.relative protein expression; <0.01 compared with control

3 討論

心臟移植引起的 I/RI目前尚無理想的治療方法，蘿卜硫素在預(yù)防 I/RI腎損傷具有一定的作用[8]，蘿卜硫素可逆轉(zhuǎn)腎臟 I/RI后凋亡相關(guān)分子的高表達(dá)。有報(bào)道蘿卜硫素對(duì)減輕 I/RI誘導(dǎo)的卵巢損傷具有保護(hù)作用[9-10]，還可抑制JNK和p38-MAPK依賴性活性氧誘導(dǎo)下的炎性反應(yīng)和凋亡，在急性肝損傷及急性壞死性胰腺炎中發(fā)揮保護(hù)作用[11-12]。本研究表明蘿卜硫素可以顯著減少大鼠同種異體心臟移植術(shù)后大鼠的病死率，降低凋亡相關(guān)分子caspase-3和bax的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心臟I/RI，提示蘿卜硫素對(duì)心肌I/RI的保護(hù)作用可能通過抗凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。

最新研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路激活后，可通過使失活GSK-3β抑制mPTP開放，從而保護(hù)細(xì)胞 I/RI[13]，那么蘿卜硫素可否通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，使GSK-3β失活來抑制mPTP的開放，從而減輕在臨床心臟移植的心肌 I/RI，目前尚無相關(guān)研究。

本結(jié)果顯示，蘿卜硫素處理組中Akt和GSK-3β蛋白的磷酸化水平較對(duì)照組顯著增加,GSK-3β下游的凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達(dá)在蘿卜硫素治療后顯著降低，表明蘿卜硫素可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β通路抑制心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，蘿卜硫素可減少缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌病理改變，通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路，使GSK-3β失活，抑制mPTP開放，保護(hù)移植心臟。此結(jié)果為提高心臟移植手術(shù)中心肌的保護(hù)提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。