陳 茜，劉 憲，崔 南，翟 陽(yáng)

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710061; 2.陜西省腫瘤醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，陜西 西安 710061)

在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌(cervical cancer)是女性第二大高發(fā)和第三大致死性癌[1]。其發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性健康。隨著腫瘤的基因治療逐漸成為研究熱點(diǎn)，探尋與宮頸癌相關(guān)的原癌基因并為診斷和治療宮頸癌提供新的研究方向至關(guān)重要。

EZH2(enhancer of zeste homolog 2)位于人染色體7q35 位點(diǎn), 參與細(xì)胞周期、分化和凋亡等多種生理或病理過(guò)程[2-3]。在腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞EZH2的高表達(dá)或者突變可以誘發(fā)肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤的發(fā)生和演變[4]，靶向EZH2有望成為癌治療的新策略，目前關(guān)于EZH2在宮頸癌中的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌組織和細(xì)胞中EZH2的表達(dá)，探討敲除其表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制，以期為宮頸癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床組織標(biāo)本的采集與細(xì)胞系：本研究所用的正常宮頸組織、宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本取自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年12月至2014年3月間婦產(chǎn)科住院患者，年齡29～73歲，平均年齡48歲，其中正常宮頸40例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌62例。正常宮頸組織來(lái)源于子宮肌瘤子宮全切患者。侵襲型宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前均未接受放射治療、化學(xué)治療或免疫治療，住院后行廣泛全子宮及雙側(cè)附件切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后病理確診。所有收集標(biāo)本組織切成1 cm×1 cm×1 cm組織方塊，用蠟塊包埋后行連續(xù)切片，厚度4 μm左右，載玻片行多聚L-賴(lài)氨酸處理。本研究已獲得西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)[2016倫審科學(xué)第(117)號(hào)]及受試者簽署的知情同意書(shū)。人宮頸癌HeLa、人子宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞系(ATCC細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 主要試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司)，胎牛血清(Hyclone公司)；青霉素、鏈霉素(Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，EZH2-knockout質(zhì)粒及其control 質(zhì)粒(美國(guó)麻省理工學(xué)院科學(xué)家張鋒實(shí)驗(yàn)室)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:復(fù)蘇HeLa和SiHa細(xì)胞后，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)增殖期的HeLa和SiHa細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別取對(duì)數(shù)增殖期的HeLa和SiHa細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合時(shí)，按Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)提供的方法分別將EZH2-knockout質(zhì)粒及其control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa和SiHa細(xì)胞中[5]。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):從細(xì)胞中提取蛋白。經(jīng)BCA 蛋白定量法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE，應(yīng)用Bio-Rad濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入5%脫脂牛奶稀釋的一抗(1∶1 000稀釋的兔抗人EZH2、鼠抗人STAT3、兔抗人p-STAT3和鼠抗人GAPDH抗體)在4 ℃孵育過(guò)夜，與相應(yīng)的1∶10 000稀釋的二抗在室溫孵育1 h，加ECL發(fā)光劑，用Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)一體機(jī)進(jìn)行曝光，采用ImageJ2×軟件進(jìn)行吸光度(A)值分析。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移:將EZH2-knockout及對(duì)照的HeLa和SiHa細(xì)胞種于35 mm培養(yǎng)皿中，24 h后用滅菌的20 μL量程的小槍頭尖端進(jìn)行劃痕，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗多次，加入無(wú)血清的普通DMEM高糖培養(yǎng)液后拍照(0 h)，并顯微鏡下記錄拍照位置。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h取出后拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用ImageJ2×軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞體外遷移和侵襲:將基質(zhì)膠(Matrigel)4 ℃過(guò)夜融化，用無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)液以1∶8濃度稀釋?zhuān)總€(gè)侵襲小室加100 μL稀釋后的Matrigel(細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)不包括此步)，小室放入24孔板中，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使Matrigel形成凝膠狀。之后在Transwell 小室的上下室均加入500 μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中30 min，取處于對(duì)數(shù)增殖期的EZH2-knockout和對(duì)照細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞為2×105個(gè)/mL，侵襲小室上室加400 μL細(xì)胞懸液，侵襲小室下室加1 mL含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24及48 h后，取出小室用75%乙醇溶液固定后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，PBS洗滌后將小室底面朝上，自然晾干，置于顯微鏡下觀察并拍照，上下左右隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)穿過(guò)聚碳酸脂膜的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用ImageJ2×軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)細(xì)胞中STAT3的表達(dá):Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，GAPDH為內(nèi)參。引物序列：GAPDH-F：5′-GCACCGTCAAGG CTGAGAAC-3′,GAPDH-R：5′-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3′；STAT3-F：5′-CACCAAGCGAGGACTGAGCAT C-3′,STAT3-R：5′-AGCCAGACCCAGAAGGAGAAGC-3′。按照SYBR?Premix Ex TaqTM說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)條件為第1步(1個(gè)循環(huán))95 ℃ 30 s；第2步(40個(gè)循環(huán))95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，第3步溶解(1個(gè)循環(huán))。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EZH2 在宮頸癌組織中高表達(dá)

在正常宮頸組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌EZH2表達(dá)的陽(yáng)性率分別為12.5%和74.2%(P<0.05)。EZH2在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的評(píng)分高于正常宮頸組織(P<0.05)。

EZH2蛋白在5個(gè)宮頸癌細(xì)胞系均有不同程度的表達(dá)，遂應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa細(xì)胞中EZH2的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞測(cè)序和Western blot鑒定[5]。

2.2 敲除EZH2抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力

敲除EZH2后劃痕愈合速度顯著慢于對(duì)照組,其中敲除EZH2組HeLa和SiHa細(xì)胞的劃痕愈合率24與48 h均低于對(duì)照組(P<0.05，圖1A,B)。

A,B.effect of EZH2 knockout on the migration of HeLa and SiHa cells was detected by cell scratch assay; *P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

2.3 敲除EZH2抑制宮頸癌細(xì)胞的Transwell體外遷移能力

敲除EZH2后Transwell 小室遷移穿膜細(xì)胞數(shù)目顯著少于對(duì)照組,其中敲除EZH2組HeLa和SiHa細(xì)胞的Transwell 小室遷移穿膜細(xì)胞數(shù)目均低于對(duì)照組(P<0.05)(圖2A,B)。

A，B: Transwell migration assay was used to detect the effect of EZH2 knockout on the migration of HeLa and SiHa cells(×40，scale bar=50 μm); *P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

2.4 敲除EZH2抑制宮頸癌細(xì)胞的Transwell體外侵襲能力

敲除EZH2后Transwell 小室侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)目顯著少于對(duì)照組,其中敲除EZH2組HeLa和SiHa細(xì)胞的Transwell 小室侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)目均低于對(duì)照組(P<0.05)(圖3A,B)。

A,B.Transwell invasion assay was used to detect the effect of EZH2 knockout on the invasion of HeLa and SiHa cells(×40，scale bar=50 μm); *P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

2.5 敲除EZH2可能通過(guò)STAT3信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲

敲除EZH2組HeLa和SiHa細(xì)胞STAT3的mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有差異(圖4A)。在HeLa和SiHa細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，敲除EZH2后p-STAT3 蛋白水平明顯降低(P<0.05)，而STAT3總蛋白表達(dá)沒(méi)有變化(圖4B,C)。

A.expression of STAT3 mRNA in EZH2 knockout group and control group was detected by RT-qPCR; B，C.Western blot was used to detect the protein levels of STAT3 and p-STAT3;*P<0.05 compared with CRISPR-Ctrl

3 討論

宮頸癌是發(fā)生于子宮頸部位的惡性腫瘤，近年來(lái)宮頸癌的發(fā)病趨于年輕化，其預(yù)后往往較差，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。目前中晚期宮頸癌5年生存率仍無(wú)明顯的提高，患者的生存質(zhì)量也沒(méi)有得到明顯改善。這就要求進(jìn)一步去研究宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，推進(jìn)宮頸癌的預(yù)防、診斷及分子治療的發(fā)展和改進(jìn)[6]。

研究發(fā)現(xiàn)EZH2在多種腫瘤中均呈高表達(dá)，被認(rèn)為是一個(gè)新的候選癌基因，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后均有顯著相關(guān)性，因此抑制EZH2 的表達(dá)可減緩腫瘤的生長(zhǎng)[7]。表明EZH2 在研究腫瘤發(fā)病機(jī)制和治療等方面具有較高的潛在價(jià)值。前期研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在宮頸癌組織中高表達(dá)，并應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)在HeLa和SiHa細(xì)胞中敲除EZH2，作為后續(xù)研究工具細(xì)胞。

在非小細(xì)胞肺癌EZH2的高表達(dá)促使其侵襲及遷移能力增強(qiáng)[8]。在三陰性乳腺癌，EZH2可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制TIMP2，從而提高M(jìn)MP-2 and MMP-9的活性來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。抑制EZH2 的表達(dá)能降低前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[10]。本研究結(jié)果表明，抑制EZH2的表達(dá)能抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。STAT3是STAT轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移等病理生理過(guò)程[11]，STAT3信號(hào)通路被證實(shí)與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。在膀胱癌，EZH2水平與腫瘤組織學(xué)分期和分級(jí)相關(guān)，其表達(dá)水平越高，侵襲性越強(qiáng)，腫瘤分期越晚，相應(yīng)預(yù)后越差，并通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路控制膀胱癌細(xì)胞的增值、侵襲與轉(zhuǎn)移[14]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤磷酸化的EZH2通過(guò)甲基化STAT3增加p-STAT3的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致STAT3信號(hào)通路活性增強(qiáng)，侵襲性增強(qiáng)[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中抑制EZH2的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致p-STAT3表達(dá)量下降，并導(dǎo)致STAT3信號(hào)通路活性減低。

總的來(lái)說(shuō)，本研究結(jié)果證實(shí)EZH2影響了HeLa和SiHa細(xì)胞的遷移和侵襲，參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞功能，同時(shí)顯示其發(fā)揮作用可能與STAT3信號(hào)通路有關(guān)。這為今后研究宮頸癌的發(fā)病原因提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，提示EZH2可作為臨床治療宮頸癌的分子靶點(diǎn)，或聯(lián)合其他藥物進(jìn)行特異性靶向治療，為宮頸癌的治療開(kāi)辟了新思路。但EZH2 在宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲作用中的活化狀態(tài)下STAT3如何調(diào)節(jié)下游靶基因的中間環(huán)節(jié)具體機(jī)制，以及侵襲的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均還有待于進(jìn)一步研究。