宋昊昕，葉菜英，朱 蕾

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理系，北京 100005)

Blau綜合征(Blau syndrome, BS)是一種罕見(jiàn)的肉芽腫性自身炎性疾病，呈常染色體顯性遺傳模式，于1985年由Blau首次描述而得名。該病發(fā)病年齡早，具有非干酪樣肉芽腫性炎性反應(yīng)病史特征，典型臨床表現(xiàn)為皮疹、關(guān)節(jié)炎和葡萄膜炎“三聯(lián)征”，進(jìn)行性加重，可能導(dǎo)致失明和關(guān)節(jié)破壞等嚴(yán)重并發(fā)癥。BS由NOD2/CARD15突變導(dǎo)致，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，而沒(méi)有合適的研究模型是重要的原因[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，NOD2R314Q(對(duì)應(yīng)BS患者最常見(jiàn)的R334Q突變類型)轉(zhuǎn)基因小鼠并沒(méi)有出現(xiàn)BS患者類似的炎性反應(yīng)，而對(duì)BS的細(xì)胞模型也缺乏系統(tǒng)性的研究[2]。

因此，本研究探索用胞壁酰二肽(muramyl dipeptide, MDP)或L18-MDP[MDP-Lys(L18),MDP with C18 fatty acid chain]誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7、永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞系(immorta-lized bone marrow-derived macrophage，iBMDM)和人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(THP-1)，構(gòu)建BS的體外細(xì)胞模型，并通過(guò)考察其對(duì)BS的臨床治療藥物TNF-α抑制劑依那西普(etanercept, ETN)和臨床前在研藥物GSK583的響應(yīng)以評(píng)價(jià)該模型的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(THP-1)、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基雙抗(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；永生化骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(iBMDM)(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院李濤教授饋贈(zèng))；胎牛血清(FBS，Gibco公司)；MDP(Sigma-Aldrich公司)；L18-MDP(InvivoGen公司)；佛波酯[(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司]；依那西普[重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，三生國(guó)健藥業(yè)(上海)股份有限公司]；GSK583(MedChemExpres公司)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒和人TNF-α ELISA試劑盒(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)：將RAW264.7細(xì)胞、iBMDM細(xì)胞和THP-1細(xì)胞分別接種于10 cm培養(yǎng)皿中，RAW264.7細(xì)胞和iBMDM細(xì)胞的培養(yǎng)基為含有10% FBS的DMEM(含雙抗)，THP-1細(xì)胞的培養(yǎng)基為含有10% FBS的RPMI 1640(含雙抗)。細(xì)胞置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合度時(shí)，用胰蛋白酶進(jìn)行定期消化和傳代。

1.2.2 RAW264.7細(xì)胞和iBMDM細(xì)胞的分組和干預(yù)：按照1.5×105個(gè)細(xì)胞/孔將RAW264.7細(xì)胞和iBMDM細(xì)胞接種于24孔板中。細(xì)胞分為對(duì)照組、MDP組(加入10 μg/mL的MDP)、MDP+ETN組(同時(shí)加入10 μg/mL的MDP和100 μg/mL的ETN)和MDP+GSK583組(同時(shí)加入10 μg/mL的MDP和1 μmol/L的GSK583)。各組細(xì)胞培養(yǎng)22 h后收集上清，-20 ℃保存。

1.2.3 THP-1細(xì)胞的分組和干預(yù)：分為2個(gè)實(shí)驗(yàn)方案：1)未經(jīng)PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞給予MDP(10 μg/mL)，L18-MDP(0.2和1 μg/mL)或在給予L18-MDP刺激的同時(shí)加入ETN(100 μg/mL)。2)使用PMA(50 ng/mL)孵育THP-1細(xì)胞2 d，誘導(dǎo)其由單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞(Mφ)。誘導(dǎo)分化的THP-1-Mφ在給予L18-MDP(0.2 μg/mL)刺激的同時(shí)加入ETN(100 μg/mL)。培養(yǎng)22 h后收集上清，-20 ℃保存。

1.2.4 TNF-α的檢測(cè)：使用ELISA測(cè)定細(xì)胞上清中TNF-α的含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7細(xì)胞模型建立及對(duì)ETN和GSK583的響應(yīng)

與對(duì)照組相比，MDP(10 μg/mL)刺激22 h后，RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的水平顯著增加(P<0.01)，ETN和GSK583對(duì)MDP刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α水平均有明顯抑制作用(P<0.01)(圖1)。

#P<0.01 compared with control group(0 μg/mL MDP); *P<0.01 compared with MDP group(10 μg/mL)

2.2 iBMDM細(xì)胞模型建立及對(duì)ETN和GSK583的響應(yīng)

與對(duì)照組相比，MDP(10 μg/mL)刺激22 h后，iBMDM細(xì)胞分泌TNF-α的水平顯著增加(P<0.05)，ETN和GSK583對(duì)MDP刺激的iBMDM細(xì)胞分泌TNF-α水平均有明顯的抑制作用(P<0.01)(圖2)。

#P<0.01 compared with control group(0 μg/mL MDP); *P<0.01 compared with MDP group(10 μg/mL MDP)

2.3 THP-1細(xì)胞模型建立及對(duì)ETN的響應(yīng)

MDP或L18-MDP不能增加未經(jīng)PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的水平，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。與對(duì)照組相比，經(jīng)0.2或1 μg/mL L18-MDP刺激后，經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的THP-1-Mφ上清中TNF-α水平顯著增加(P<0.01)；隨后在給予0.2 μg/mL L18-MDP刺激的同時(shí)加入ETN，結(jié)果顯示ETN對(duì)L18-MDP(0.2 μg/mL)誘導(dǎo)的TNF-α分泌水平有明顯抑制作用(P<0.01)(圖4)。

圖3 MDP(A)和L18-MDP(B)刺激未經(jīng)PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞分泌TNF-α的水平及ETN的作用

*P<0.01 compared with control group(untreated); #P<0.01 compared with L18-MDP group(0.2 μg/mL)

3 討論

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有可控性和易得性的特點(diǎn)，因此構(gòu)建適當(dāng)和可靠的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪翘剿骷膊“l(fā)病機(jī)制以及篩選治療藥物的關(guān)鍵。鑒于BS是一種固有免疫系統(tǒng)異常的疾病，因此選擇巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象。選擇的刺激劑MDP/L18-MDP是細(xì)菌細(xì)胞壁的成分，是BS致病基因NOD2編碼蛋白NOD2的主要識(shí)別配體[3]。

NOD2屬于細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體。在非活化狀態(tài)下處于自抑制狀態(tài)；受到刺激時(shí)發(fā)生寡聚化反應(yīng)，與受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2, RIP2)結(jié)合并使其磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路，介導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子等表達(dá)以保護(hù)宿主免受感染[4-6]。研究認(rèn)為，BS中由突變NOD2所編碼的NOD2受體會(huì)發(fā)生自動(dòng)活化，使NF-κB通路持續(xù)激活產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎性反應(yīng)持續(xù)過(guò)度進(jìn)行[7-8]。因此，細(xì)胞因子被認(rèn)為是BS疾病過(guò)程中的關(guān)鍵介質(zhì)，其中最為重要的是TNF-α[9]。因此本研究檢測(cè)各模型細(xì)胞在刺激后分泌TNF-α水平的改變作為衡量模型成功的觀察指標(biāo)。

目前BS沒(méi)有理想的治療藥物，近年來(lái)生物制劑給BS的治療帶來(lái)曙光，尤其TNF-α抑制劑是最常用的治療藥物[10]。而選擇性的RIP2抑制劑，如GSK583等，也被研究用于抑制NOD2激活產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞因子。因此本研究選擇ETN(一種TNF-α抑制劑)和GSK583考察細(xì)胞模型對(duì)藥物的響應(yīng)以評(píng)價(jià)模型的有效性。

結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)10 μg/mL MDP刺激后，上清中TNF-α含量顯著升高。與本研究一致的是，使用10 μg/mL MDP刺激RAW264.7細(xì)胞后檢測(cè)上清中TNF-α水平以作為篩選RIP2抑制劑的模型[11]。然而，目前尚無(wú)使用iBMDM制備模型的報(bào)道。本研究首次使用10 μg/mL MDP誘導(dǎo)iBMDM細(xì)胞，成功建立了BS的細(xì)胞模型。THP-1 細(xì)胞是目前研究人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞功能應(yīng)用最普遍的體外模型細(xì)胞。L18-MDP是含有硬脂酰脂肪酸的MDP的6-O-?；苌?，具有比MDP更強(qiáng)大的效能。針對(duì)THP-1細(xì)胞，采用0.2 μg/mL L18-MDP刺激PMA誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，可獲得較優(yōu)的模型。

綜上所述，10 μg/mL MDP刺激RAW264.7和iBMDM細(xì)胞，以及0.2 μg/mL L18-MDP刺激經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的THP-1細(xì)胞可建立良好的BS體外細(xì)胞模型，模型具有簡(jiǎn)單方便、容易重復(fù)操作以及可控性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，這為進(jìn)一步研究BS的發(fā)病機(jī)制以及篩選和評(píng)估治療藥物奠定基礎(chǔ)。