任靜 李杰茹 郭亞凈 楊勝昌 韓聚強 李文雅 趙洋 吉恩生

(河北中醫(yī)學(xué)院 1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050020；2生理教研室；3低氧生理與病理生理實驗室)

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)的主要危害是慢性間歇性低氧(CIH)造成心、腦、腎、血管等多臟器損害〔1〕。OSA誘發(fā)心臟病變是源于CIH引起的心肌組織代謝紊亂和結(jié)構(gòu)異常。CIH是OSA患者易合并心血管病變?nèi)绺哐獕?、冠心病和心力衰竭的病理基礎(chǔ)〔2〕。研究表明CIH引起的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、交感神經(jīng)興奮性增加、內(nèi)皮功能損傷等是OSA 并發(fā)心血管病變的主要機制〔3〕。心臟局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在OSA誘發(fā)心臟病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔4〕。抑制局部 RAS 的激活，阻斷 RAS 的作用可作為預(yù)防和治療的OSA引發(fā)心臟病變重要環(huán)節(jié)。消痰化瘀利竅方(XHLR) 是針對于OSA的“痰濕、血瘀、氣滯”等病機特點而創(chuàng)設(shè)的有效組方，多年的臨床實踐證明，該方對OSA患者具有較好的臨床治療效果。前期研究結(jié)果顯示，XHLR可抑制 CIH 大鼠心肌纖維化和心肌肥大等病變〔5〕，提示XHLR對預(yù)防OSA繼發(fā)心臟病變具有較好的效果。鑒于此，本研究基于心肌局部 RAS 探討XHLR緩解 CIH 大鼠心肌病變的初步機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級的雄性SD大鼠，體重180～220 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號:SCXK〔京〕2016-0006。

1.1.2藥物 XHLR由丹參30 g、赤芍15 g、生黃芪15 g、茯苓15 g、枳殼15 g、法半夏12 g、炒白術(shù)12 g、石菖蒲12 g、郁金12 g、射干12 g、桔梗12 g、川芎12 g、地龍12 g、陳皮10 g、白芥子10 g組成。按以上組方比例由河北省神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司購進(jìn)各藥材飲片。由本校中藥化學(xué)教研室制備實驗用藥液。應(yīng)用水煮醇沉制備工藝將以上中藥飲片制備成生藥含量為 2.5 g/ml的液體藥劑。

1.1.3試劑 血管緊張素(Ang)Ⅱ及醛固酮酶聯(lián)免疫試劑盒購于南京建成生物工程研究所；兔抗鼠c-jun抗體、兔抗鼠AngⅡ受體1(AT1R)抗體、兔抗鼠蛋白激酶(PK)C抗體及兔抗鼠Tublin單克隆抗體均購于武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1CIH造模及分組 SD大鼠隨機分為常氧(Normoxia)組、中藥對照(Formula)組、CIH組、CIH+中藥干預(yù)(Formula+CIH)組，每組8只。在動物實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，進(jìn)行CIH造模。動物CIH艙的制備流程，首先向艙內(nèi)充入100%N2，時間持續(xù)1.5 min，使艙內(nèi)O2濃度降至9%后，再向艙內(nèi)充入醫(yī)用純氧1.5 min，使艙內(nèi)O2濃度升至 21%，3 min為一循環(huán)。CIH組和Formula+CIH組的大鼠暴露于CIH艙，每天8 h(9∶00～17∶00)，持續(xù)3 w。此外，F(xiàn)ormula+CIH組與 Formula組的大鼠在每次上艙前開始灌胃給藥，XHLR藥量25 g/(kg·d) (參照動物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表計算動物用藥劑量)，CIH組與Normoxia 組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)3 w。于造模3 w后，大鼠禁食12 h后，戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉，頸總動脈采血后，開胸取出心臟，一部分心臟組織置于4%的多聚甲醛液中固定，備用于免疫組織化學(xué)染色，另一部分放入-80℃冰箱中保存，供Western印跡，q-PCR檢測。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色法檢測心肌組織AT1R 表達(dá) 石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化、3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，5%～10%正常山羊血清封閉修復(fù)抗原后，滴加一抗(1∶100)工作液，4℃過夜。PBS 沖洗后，滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液37℃孵育60 min，滴加適量的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育30 min，PBS沖洗后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色。

1.2.3RAS相關(guān)指標(biāo) 取左心室肌組織適量，制成勻漿液，4 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液于-80℃凍存?zhèn)溆?。按酶?lián)免疫法測定勻漿液AngⅡ及醛固酮含量。

1.2.4心肌組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE) mRNA 及ACE2表達(dá)測定 取適量凍存的心肌組織，用Trizol試劑提取總RNA，用通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(RR047A,TaKaRa，大連)將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR，所需反應(yīng)溶液包含40 ng cDNA、目的基因特異性引物和2 X寶生物染料法熒光定量試劑盒(RR820A,TaKaRa，大連)。以 GAPDH 作為內(nèi)參。根據(jù)以下參數(shù)見Table1進(jìn)行反應(yīng)：預(yù)變性95℃×5 min，變性 94℃×30 s，退火 60℃×30 s，延伸72℃×30 s，共 40 個循環(huán)。用熒光定量PCR(Bio-Rad，CFX Connection，Hercules，USA)檢測PCR擴增。引物序列見表1。用ΔΔCt 值法，以 GAPDH 為內(nèi)參定量目的基因(ACE、ACE2) mRNA表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.2.5Western印跡檢測蛋白表達(dá) 將適量心肌組織制成勻漿，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速將所制勻漿在4℃溫度下離心15 min后，取其上清，采用二喹啉甲酸(BCA)法測其蛋白濃度，制成蛋白樣品。取適量蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉 1.5 h，TBST液洗滌3次，然后分別給予1∶1 000 稀釋的兔抗大鼠PKC抗體、兔抗大鼠c-jun抗體，4℃冰箱孵育過夜;TBST沖洗，加入滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育1.5 h，TBST 洗滌，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，灰度掃描后，用 Quantity One 分析軟件對蛋白電泳條帶進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度/內(nèi)參Tublin條帶灰度值表示所測指標(biāo)的蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1XHLR降低CIH大鼠心肌組織中 Ang Ⅱ、醛固酮的含量 與Normoxia組比較，CIH組心肌組織中 Ang Ⅱ、醛固酮的含量明顯升高，而與CIH組相比，CIH+Formula組 Ang Ⅱ、醛固酮的含量明顯降低，見表2。

表2 各組心肌組織 AngⅡ、醛固酮的含量

2.2各組ACE、ACE2 mRNA表達(dá)比較 與Normoxia組相比，CIH組心肌組織中ACE mRNA表達(dá)水平明顯增多，ACE2 mRNA表達(dá)下降。與CIH組比較，CIH+Formula組心肌組織中ACE mRNA表達(dá)被抑制，ACE2 mRNA表達(dá)水平明顯升高，見表3。

表3 Q-PCR法檢測各組心肌組織 ACE和ACE2 mRNA表達(dá)

2.3XHLR抑制CIH大鼠心肌組織中PKC和c-jun蛋白的表達(dá) 與Normoxia組比較，CIH組心肌組織中PKC和c-jun蛋白表達(dá)水平升高，而與CIH組相比，CIH+Formula組心肌組織中PKC和c-jun蛋白表達(dá)水平明顯下降。見圖1、表4。

1～4：Normoxia組，CIH組，F(xiàn)ormula+CIH組，F(xiàn)ormula組圖1 Western印跡法檢測各組心肌組織 PKC和c-jun蛋白表達(dá)水平

表4 各組PKC、c-jun、AT1R表達(dá)比較

2.4XHLR降低CIH大鼠心肌組織中AT1R的表達(dá) 與Normoxia組比較，CIH組心肌組織中AT1R蛋白表達(dá)水平升高，與CIH組相比，CIH+Formula組心肌組織中AT1R蛋白表達(dá)明顯下降。見表4、圖2。

圖2 各組心肌組織AT1R的表達(dá)情況(DAB，×400)

3 討 論

OSA 的主要病理生理特征是夜間睡眠過程中反復(fù)發(fā)生的間歇性低氧(IH)，這種反復(fù)的低氧、復(fù)氧刺激機體的內(nèi)分泌機制，并且激活循環(huán)中的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)〔6，7〕。循環(huán)中的RAAS,由腎臟的球旁細(xì)胞分泌的腎素進(jìn)入循環(huán)血，降解肝臟分泌的血管緊張素原生成AngⅠ,AngⅠ再在ACE的作用下生成AngⅡ。AngⅡ引起血管收縮、刺激醛固酮產(chǎn)生、促使水鈉潴留、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增生等效應(yīng)，使血壓升高〔8〕。IH可以通過激活循環(huán)RAAS誘導(dǎo)高血壓的發(fā)生〔9〕。CIH可以刺激頸動脈體的化學(xué)感受器，從而激活全身交感神經(jīng)系統(tǒng)和RAS〔10〕。將大鼠暴露于低氧環(huán)境中7 d 后，監(jiān)測到其 ACE、AngⅡ與 AT1R水平較正常對照組顯著增加〔11〕。并且近年來研究發(fā)現(xiàn)CIH也可激活心臟局部RAS進(jìn)而促進(jìn)心血管病變的發(fā)展〔4〕。作為RAS關(guān)鍵酶的ACE，通過多種分泌方式參與RAS的全身和局部作用。AngⅡ是ACE的產(chǎn)物，ACE可通過產(chǎn)生AngⅡ損傷心血管系統(tǒng)〔12〕。本研究提示XHLR通過抑制CIH誘導(dǎo)ACE基因的表達(dá)，使Ang Ⅱ和醛固酮生成減少，以減緩輕心肌病變的發(fā)生。

ACE2作為RAS的一個新成員，可以抑制RAS，并具有血管舒張和抗增殖功能〔13〕。ACE2 是一種專一的單羧基肽酶，可以將AngⅠ降解為Ang(1～9)，同時可將Ang Ⅱ降解為Ang(1～7)，但ACE2分解Ang Ⅱ的速率遠(yuǎn)高于其分解AngⅠ〔14〕。因此，激活 ACE2活性，是降低 AngⅡ的重要途徑之一，可有效地降低血壓〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)，CIH模型大鼠心肌組織ACE2 基因表達(dá)明顯降低。XHLR可使心肌ACE2 mRNA表達(dá)水平升高，減緩心肌病變的發(fā)生。

AngⅡ 作為 RAS的重要成員之一，與受體結(jié)合后發(fā)揮其生理與病理作用，一般認(rèn)為其受體主要有 AT1R和AT2R兩種,AngⅡ與AT1R結(jié)合產(chǎn)生收縮血管及促進(jìn)炎癥發(fā)生等作用〔16〕，還可增加氧化應(yīng)激、凋亡和心臟重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭〔17〕。本研究提示XHLR可減弱CIH誘導(dǎo)的AngⅡ生成，降低AT1R的表達(dá)。

RAS在心血管系統(tǒng)病變中扮演的重要的角色，心肌組織中的AngⅡ 通過自分泌和(或)旁分泌機制作用于AT1R，經(jīng)G蛋白耦聯(lián)作用，激活磷脂酰肌醇特異性磷酸酯酶C，引起心肌細(xì)胞膜外鈣離子跨膜內(nèi)流和胞質(zhì)內(nèi)鈣離子貯存池釋放增加，并誘導(dǎo)激活PKC，進(jìn)而引發(fā)即刻早期反應(yīng)基因c-jun的表達(dá)，增加蛋白質(zhì)合成，激發(fā)心肌肥大、間質(zhì)纖維組織增生〔18〕。本研究提示XHLR可通過降低心內(nèi)RAS活性進(jìn)而阻斷PKC/c-jun通路改善CIH大鼠的心臟功能。