徐家窈 劉紅山 鄭海生 劉俐娜

(中山大學中山眼科中心海南眼科醫(yī)院 海南省眼科學重點實驗室，海南 ?？?570311)

正常角膜透明，無血管，但在炎癥、外傷、感染、缺氧等條件下，角膜緣血管網(wǎng)將增殖形成角膜新生血管(CNV)〔1〕。雖然CNV促進傷口愈合修復，減輕感染，但其結(jié)構(gòu)和功能不完善,容易發(fā)生血漿滲漏，造成脂質(zhì)沉著、角膜水腫及激發(fā)的角膜瘢痕化，這些會影響角膜透明度及后續(xù)治療效果〔2〕，顯然CNV弊大于利。生理情況下，促血管生成因子和抑血管生成因子在正常角膜組織中維持動態(tài)平衡，而當角膜處于病理情況下，二者平衡被打破，從而產(chǎn)生病理性CNV〔3〕。雙氫青蒿素(DHA)是青蒿素的一種衍生物，為青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯的體內(nèi)活性形式，具有毒性弱，生物作用強的特點，同時DHA對腫瘤細胞增殖和新生血管形成也有良好抑制效果〔4〕，但是對CNV是否有抑制作用還未見報道，本研究旨在探討DHA對CNV的抑制效果。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 DHA(美國Sigma公司)；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、p-血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-2、p-細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、p-P38、CD31抗體(美國Abc公司)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液(江蘇碧云天生物科技有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(北京索萊寶)；顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械)；熒光顯微鏡(日本 Nikon公司)，眼科顯微鏡(日本Olympus公司)；Trizol 核酸蛋白提取試劑(美國Invitrogen公司)；病理切片機及包埋機(德國 Leica 公司)。

1.2模型制備 32只SD大鼠，體重150～180 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0002，單位使用許可證編號：SYXK(瓊)2016-0021。所有大鼠使用裂隙燈顯微鏡仔細檢查眼角膜，有任何缺陷或CNV的大鼠將被排除。用10%水合氯醛腹腔注射(4 ml/kg)全身麻醉，然后用5 g/L丁卡因進行眼表麻醉，在大鼠左眼距離角緣2 mm處顳側(cè)使用10-0的手術(shù)縫線縫四根線，術(shù)后用0.3%氧氟沙星滴眼液，3次/d，持續(xù)3 d，以降低感染風險。

1.3實驗分組 32只大鼠隨機分為4組，分別為對照(NS)組、5 mg/L DHA組、10 mg/L DHA組和20 mg/L DHA組，每組8只。各濃度DHA組分別用指定濃度的DHA溶液(生理鹽水稀釋)進行局部治療，4次/d，而對照組用生理鹽水滴眼液治療，每天用裂隙燈顯微鏡觀察角膜變化，共7 d。第7天用圖像處理軟件Image-Pro Plus6.0處理圖像，計算角膜中新生血管面積。

1.4免疫熒光染色法觀察大鼠角膜p-ERK1/2、p-P38、CD31表達 第7天處死大鼠，取下角膜后于4%多聚甲醛中固定20 min，石蠟包埋切片，厚度5 μm，切片用二甲苯和乙醇脫蠟，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，0.25%胰酶孵育20 min，PBS洗滌，然后室溫下10%山羊血清孵育30 min，p-ERK1/2、p-P38、CD31 抗體4℃下孵育過夜，使用Cy3標記山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)的熒光二抗(1∶200)室溫孵育1 h，洗滌玻片，采用DAPI孵育5 min后，立即置于熒光生物顯微鏡下照相，分析觀察CNV。顯微鏡下觀察p-ERK 1/2、p-P38和CD31蛋白陽性染色結(jié)果，利用光密度值進行半定量分析。

1.5Western印跡檢測ERK1/2、P38通路相關(guān)因子表達 第7天處死大鼠，取下角膜勻漿，14 000 r/min離心5 min，完成后取上清，BCA法進行蛋白初定量，-80℃分裝保存。將提取的蛋白樣品按 20 μg/孔依次上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入VEGF、p-VEGFR-2、p-ERK1/2、p-P38抗體，在 4℃ 冰箱中孵育過夜，然后在辣根過氧化物酶標記的二抗作用中孵育 1 h。用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯影，掃描拍照。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 論

2.1DHA對縫合誘導CNV的抑制作用 NS組不僅覆蓋縫合部位，甚至達角膜中心，而各濃度DHA組在治療7 d后角膜中發(fā)現(xiàn)的血管數(shù)逐漸減少，呈濃度依賴性，見圖1；NS組、5、10、20 mg/L DHA組CNV面積比例分別為(23.74±3.00)%、(23.38±2.79)%、(19.53±2.42)%、(15.73±2.88)%，與NS組相比，10、20 mg/L DHA組CNV的抑制作用均顯著增加(P<0.05)。

2.2免疫熒光法檢測p-ERK1/2、p-P38和CD31表達 p-ERK1/2、p-P38和 CD31 蛋白主要在角膜上皮和基質(zhì)層中表達，p-ERK1/2 和p-P38陽性表達呈綠色，CD31陽性表達呈紅色，見圖2。NS組p-ERK1/2、p-P38和CD31免疫熒光光密度值分別為(156.78±30.02)、(97.43±26.10)、(73.20±33.28)，20 mg/L DHA 組分別為(44.78±7.03)、(30.18±7.28)、(19.34±4.21)，組間比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.3Western印跡檢測VEGF、p-VEGFR-2、p-ERK1/2、p-P38表達 與NS組相比，20 mg/L DHA組VEGF、p-VEGFR-2表達顯著下降(P<0.05)；而5、10 mg/L DHA組無明顯差異(P>0.05)。與NS組相比，10、20 mg/L DHA組p-ERK1/2、p-P38表達顯著下降(P<0.05)；而5 mg/L DHA組無明顯差異(P>0.05)。見表1，圖3。

3 討 論

CNV嚴重威脅視力，甚至導致失明〔5〕。在新生血管形成的眾多學說中，多數(shù)學者傾向于細胞因子學說，即認為新生血管刺激因子的過度表達或抑制因子的不足是CNV發(fā)生的基礎(chǔ)〔6〕。其中VEGF是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的促血管新生作用最強的因子，VEGF通過激活其特異性受體，介導早期的血管新生，在CNV的形成過程中起重要作用〔7〕。DHA有抗瘧疾，下調(diào)VEGF表達的作用〔8〕。

VEGF能促進內(nèi)皮細胞分裂增殖，促使新生血管生成〔9〕。VEGF這一功能是通過與其特異性受體結(jié)合來發(fā)揮作用，而VEGFR2是VEGF的主要受體，VEGF與其結(jié)合后，VEGFR發(fā)生二聚體化，形成同源二聚體或異源二聚體，進一步激活下游信號通路〔10〕。本研究結(jié)果說明20 mg/L DHA促進VEGF、p-VEGFR-2表達急劇下降，提示DHA可能通過抑制這一途徑降低CNV，而20 mg/L和10 mg/L DHA對CNV也有抑制作用，因此推測DHA的抑制能力呈劑量依賴性，但可能還有其他因素導致CNV抑制。

CD31特異性表達于血管內(nèi)皮細胞中，相對于其他內(nèi)皮細胞標記，CD31更能精確反映血管數(shù)量〔11〕；絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)主要分為3個亞族：ERK1/2、JNK、p38，它們參與多種細胞功能的調(diào)控，尤其在細胞增殖、分化及凋亡過程中，是多種信號轉(zhuǎn)導途徑的共同作用部位。文獻報道，抑制ERK1/2 信號通路可以抑制血管平滑肌細胞(VSMCs)的增殖遷移〔12〕；p38經(jīng)外界刺激而激活，引起細胞內(nèi)蛋白激酶的連鎖反應(yīng)，參與細胞周期調(diào)控并且在細胞分化中起著重要作用〔13〕。ERK1/2和P38是VEGF信號轉(zhuǎn)導的兩個主要下游蛋白〔14〕。研究表明，VEGF受體的激活會促進ERK1/2蛋白活化〔15〕。VEGF還能激活P38通路引起細胞有絲分裂及細胞遷移〔16〕。本研究結(jié)果說明經(jīng)DHA治療降低了ERK1/2、P38的磷酸化。此外，P38還是炎癥細胞因子表達的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在炎癥過程中發(fā)揮了非常重要的作用。實驗中CNV模型基于縫線會繼發(fā)角膜炎癥，因此DHA也可能通過P38途徑降低炎性細胞因子的表達抑制CNV。