代云峰 曹春姚 李昂 任明 魏環(huán)兵 賈翠英 郎尉雅 李鵬輝 鮑紅光 劉云龍 張旭東 潘洪明

(齊齊哈爾醫(yī)學院 1附屬第二醫(yī)院 檢驗科,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2附屬第二醫(yī)院心血管內五科;3基礎醫(yī)學院;4附屬第二醫(yī)院胸外科；5附屬第二醫(yī)院信息中心)

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，乳腺癌的晚期轉移已經成為該類腫瘤預后效果差的主要因素〔1～3〕。在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的過程中，癌細胞受到細胞內遺傳因素和細胞外腫瘤微環(huán)境的復雜調控。這些調控因素一方面通過影響細胞周期、DNA損傷修復等影響細胞的增殖活性，另一方面也通過調控細胞的遷移和侵襲能力影響腫瘤細胞的轉移〔4〕。研究表明，腫瘤細胞的上皮-間質轉化(EMT)是腫瘤轉移的重要步驟〔5，6〕。在EMT的過程中，細胞表面E-鈣黏蛋白(Cadherin)、N-Cadherin、波形蛋白(Vimentin)等表達上調，細胞連接和細胞極性喪失，細胞失去上皮細胞形態(tài)，轉而呈現間質細胞形態(tài)，并獲得遷移和侵襲能力〔7〕。

部分微小RNA(miRNA)對乳腺癌細胞的EMT發(fā)揮了重要的調控作用〔8〕，如miR-200可以通過靶向E盒結合鋅指蛋白(ZEB)調控多種惡性腫瘤細胞的EMT〔9，10〕。miR-107是一類非保守miRNA，被發(fā)現參與調控結胰腺癌EMT的過程〔11〕，然而其在乳腺癌中的作用還了解不多。為此，本文探究了miR-107對乳腺癌細胞系T47D、MDA-MB-231遷移和EMT的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 對照miRNA和miR-107抑制物在廣州銳博公司合成。培養(yǎng)細胞所需的DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)LipofectmineRNAi Max購自美國ThermoFisher公司；細胞總RNA提取試劑盒、莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶(M-MLV)逆轉錄酶和qPCR SuperMix購自全式金生物科技有限公司；Transwell培養(yǎng)小室購自Millipore公司；抗磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化(p)-AKT抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶耦聯的二抗購自美國SantaCruz公司。

1.2細胞培養(yǎng)和轉染 正常乳腺組織細胞系Hs578Bst和乳腺癌細胞系MCF7、HS578T、T47D和BT-549購自中國醫(yī)學科學院細胞庫。其中Hs578Bst、HS578T和MCF7細胞系培養(yǎng)在90% DMEM+10%FBS培養(yǎng)基中，T47D和BT-549細胞使用90% RPMI1640+10%FBS進行培養(yǎng)。細胞分為3組：空白轉染組、對照miRNA組和miR-107抑制劑組。對照miRNA和miR-107的轉染：取2個1.5 ml離心管中加入100 μl Opti-MEM培養(yǎng)基，隨后分別加入5 μl miRNA和5 μl轉染試劑，室溫靜置5 min后，混合并輕輕混勻，繼續(xù)靜置5 min后加入細胞培養(yǎng)基中。轉染6 h后更換新培養(yǎng)基。

1.3實時熒光定量PCR 離心收集細胞，并用PBS清洗一遍，按照RNA提取試劑盒操作說明進行總RNA提取。提取得到的總RNA用焦碳酸二乙酯(DEPC)H2O溶解，并調整濃度為0.5 μg/μl。隨后使用M-MLV逆轉錄酶進行cDNA合成。首先將總RNA與18寡聚胸腺嘧啶脫氧核糖核酸〔Oligo(dT)18〕引物混合，65℃變性5 min，后立刻冰浴退火2 min。隨后在反應體系中加入脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、M-MLV、核酸酶抑制劑，放置在PCR儀中42℃反應30 min，得到的產物即為cDNA模板。隨后使用實時熒光定量PCR混合物進行目的基因mRNA表達水平的檢測。反應體系首先經過95℃預變性30 s，隨后利用95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s的反應擴增40個循環(huán)，最后加入解離程序檢測溶解曲線。通過ΔΔCt計算得到目的基因與內參基因GAPDH相對表達水平，所用引物：E-cadherin正義鏈：5′-ACAGCACGTACACAGCCCTA-3′，反義鏈：5′-GCAGAAGTGTCCCTGTTCCAG-3′；Vimentin正義鏈：5′-AGCCGAAAACACCCTGCAAT-3′，反義鏈：5′-CGTTCAAGGTCAAGACGTGC-3′；Twist1正義鏈：5′-GGCACCATCCTCACACCTCT-3′，反義鏈：5′-GCTGA-TTGGCACGACCTCT-3′；N-cadherin正義鏈：5′-ATTGGACCATCACTCGGCTTA-3′，反義鏈：5′-CACACTGGCAAACCTTCACG-3′；GAPDH正義鏈：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義鏈：5′-TGGTGA-AGACGCCAGTGGA-3′；miR-107正義鏈：5′-CATACTAGTGTCTTCTGGACAGGCTCTG-3′，反義鏈：5′-CTTAAGCTTA-GAATCTCTCACATACACAC-3′。

1.4細胞劃痕試驗 將細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后分別轉染對照miRNA和miR-107模擬物，轉染6 h后換液，使得細胞繼續(xù)呈單層貼壁生長狀態(tài)直至細胞匯合度達到80%～90%。用1 ml移液器槍頭在孔板底部劃一條直線，隨后在于第一條直線垂直的方向劃一條相交的直線。劃線完成后，用PBS清洗2次，去除脫落的細胞，隨后加入新鮮培養(yǎng)基。在劃線后0 h和24 h用倒置相差顯微鏡對同一劃線位置進行拍照，并用Image J軟件測量劃痕面積(S)，則24 h時細胞遷移率=(S0 h-S24 h)/S0 h×100%。

1.5細胞侵襲實驗 將正常傳代培養(yǎng)的細胞接種于6 cm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后分別轉染對照miRNA和miR-107抑制物，轉染6 h后更換無血清培養(yǎng)基，饑餓處理24 h。隨后用胰蛋白酶消化細胞，并離心用PBS清洗1次，用無血清培養(yǎng)基重懸并調整細胞密度為5×105個/ml。取200 μl細胞接種于預先包被基質膠的Transwell培養(yǎng)小室中，并將小室放置在含有10% FBS完全培養(yǎng)基的24孔細胞培養(yǎng)板中，與37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后取出Transwell小室，用棉簽拭去小室內的基質膠和細胞，并用4%甲醛溶液固定10 min。隨后用0.1% 結晶紫溶液對遷移至小室底部的細胞進行染色10 min，在體視顯微鏡下對染色后的小室底部細胞進行拍照，并用Image J軟件統計單位面積上的細胞數目。

1.6蛋白質免疫印跡實驗 轉染對照miRNA或miR-107模擬物的細胞經過消化、離心收集后，用PBS重懸細胞，并用冰浴超聲的方式對細胞進行裂解。細胞裂解液經過4℃，12 000 r/min離心去除細胞碎片，收集上清加入5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，100℃水浴加熱10 min，得到變性的全細胞蛋白樣品。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對蛋白樣品進行分離，隨后將蛋白樣品轉印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。使用5%的脫脂牛奶在室溫封閉帶有蛋白樣品的PVDF膜，隨后加入一抗稀釋液，室溫孵育1 h，再加入二抗稀釋液，室溫孵育45 min。最后PVDF膜經過漂洗后，加入化學反光底物對膜上蛋白進行顯色，并使用凝膠成像儀獲取蛋白條帶信息。

1.7統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1miR-107在乳腺癌細胞系中表達 與正常乳腺組織細胞Hs578Bst(1.00±0.00)相比，miR-107在乳腺癌細胞系HS578T(2.79±0.34)、MCF7(1.49±0.22)、T47D(1.86±0.41)和BT549(1.22±0.12)中表達水平均顯著上升(t=9.002、9.002、3.762、3.606，P<0.001,P<0.05)。

2.2沉默miR-107對乳腺癌細胞系HS578T遷移的影響 空白轉染組細胞遷移率為(71.46±6.89)%。與對照miRNA組相比，miR-107抑制劑組細胞遷移率明顯降低〔(69.13±5.77)% vs (54.84±6.25)%,t=3.315,P<0.05〕，表明沉默miR-107可以抑制乳腺癌細胞的遷移。

2.3沉默miR-107對乳腺癌細胞系HS578T侵襲能力的影響 空白轉染組細胞侵襲數為(32.3±4.9)個。與對照miRNA組相比，miR-107抑制劑組侵襲細胞數明顯減少〔(30.8±4.7)個 vs (23.5±5.4)個，t=2.884，P<0.05〕。見圖1。

圖1 結晶紫染色顯示各組侵襲到下室的HS578T細胞(×100)

2.4沉默miR-107對乳腺癌細胞系EMT的影響 與對照miRNA組相比，miR-107抑制劑組HS578T細胞中E-cadherin mRNA表達水平顯著下降，而N-cadherin、Vinmentin和Twist的mRNA表達水平上調(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.5沉默miR-107對乳腺癌細胞系HS578T PTEN/AKT信號通路的影響 與對照miRNA組相比，miR-107抑制劑組24 hHS578T細胞中PTEN蛋白的表達水平明顯下調(0.98±0.16 vs 0.45±0.11；t=4.728，P<0.05)，而磷酸化(p)-AKT的水平則明顯上升(0.34±0.07 vs 0.68±0.09；t=5.165，P<0.05)，見圖2。表明miR-107通過PTEN調控了AKT信號通路。

圖2 蛋白質免疫印跡實驗檢測各組細胞PTEN、p-AKT表達水平

3 討 論

miRNAs在調控腫瘤細胞的增殖、遷移、浸潤等方面發(fā)揮了重要的作用，部分miRNAs中腫瘤組織中的表達水平與疾病的惡性程度和預后有明顯的相關性〔12，13〕。miR-107已經被發(fā)現在胃癌〔14〕、肝癌〔15〕、胰腺癌〔16〕等多種惡性腫瘤組織中表達水平呈現異常，而這種異常的表達很可能跟腫瘤的發(fā)生和轉移密切相關。下調miR-107的表達也會影響多種腫瘤細胞的增殖、遷移等過程〔17〕。在乳腺癌組織中也發(fā)現了miR-107表達水平的上調，其表達水平與乳腺癌的淋巴轉移有明顯相關性〔18〕，但miR-107對乳腺癌疾病發(fā)展的調控作用還不是特別清楚。

本研究發(fā)現，沉默miR-107的表達顯著抑制乳腺癌細胞系的遷移和侵襲能力。腫瘤細胞的EMT是指腫瘤細胞失去上皮細胞形態(tài)，而轉變?yōu)殚g質細胞類型，伴隨這一過程往往會讓腫瘤細胞獲得侵襲和轉移的能力。EMT一個重要特點是細胞間的連接減少，細胞膜蛋白E-cadherin表達水平下調，而N-cadherin的表達水平上升，此外，發(fā)生EMT的細胞中也會出現Vinmentin及相關轉錄因子Twist表達水平的上升〔6〕。本研究說明沉默miR-107促進了乳腺癌細胞EMT的過程。因此miR-107對乳腺癌細胞侵襲能力的影響很可能是通過對其EMT過程的調控實現的。

miR-107在多種腫瘤中通過調控不同的靶蛋白發(fā)揮不同的作用。在宮頸癌細胞中，miR-107通過靶向髓樣細胞白血病(MCL)1調控共濟失調-毛細血管擴張和Rad3相關蛋白(ATR)/細胞周期檢驗點激酶(Chk)1信號通路，并影響細胞侵襲〔19〕；在胃癌細胞中，miR-107則靶向神經纖維瘤蛋白(NF)1和DICER1調控胃癌細胞的侵襲和轉移〔20，21〕，影響疾病進展；在肝癌細胞中，miR-107被發(fā)現可以靶向Axin2蛋白〔22〕。miRNA對底物蛋白的調控作用通常是通過與其mRNA結合，影響mRNA的穩(wěn)定性及其轉錄活性，進而影響下游蛋白的表達。此外，有研究表明，miR-107可以直接靶向EMT關鍵調節(jié)蛋白PTEN〔11〕。本研究也發(fā)現，在乳腺癌細胞HS578T中，沉默miR-107同樣可以抑制PTEN蛋白的表達，進而促進細胞AKT的磷酸化修飾。綜上所述，在乳腺癌細胞系中表達水平顯著上升，而沉默miR-107的表達則可以通過靶向PTEN/AKT信號通路，促進細胞EMT，影響乳腺癌細胞的遷移和侵襲。提示miR-107不僅可以作為腫瘤標志物，也可能作為新的藥物作用靶點用于乳腺癌的臨床治療中。