朱琳 任宇倩 倪欽帥 李義召 任雷鳴 郭云良

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266021；2濟(jì)南房干康復(fù)醫(yī)院；3河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所)

衰老是一種生物過程，其特點(diǎn)是生理功能逐漸退化，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率上升。衰老是大腦衰退的主要因素之一，涉及逐漸的學(xué)習(xí)和記憶喪失，認(rèn)知障礙和癡呆癥，如阿爾茨海默病〔1，2〕。 Harley等〔3〕在1990年提出了衰老的端粒學(xué)說，端粒磨損是導(dǎo)致衰老的重要因素〔4，5〕，而端粒長度的維持主要依賴于端粒酶的活性。腦內(nèi)端粒酶活性的降低可引起神經(jīng)元衰老和死亡，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能衰退〔6〕，這提示激活端粒酶可能是保護(hù)神經(jīng)元和延緩腦衰老的有效方法。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)是端粒酶催化亞基，在端粒酶活性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控端粒酶的表達(dá)。TERT可被多種轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)從而增加端粒酶活性，其中信號傳感器和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3已被證實(shí)是TERT的重要激活因子〔7〕。磷酸化STAT3是STAT3的主要活性形式，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。有研究表明，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)和上調(diào)STAT的磷酸化水平〔8〕，可以促進(jìn)神經(jīng)再生，改善神經(jīng)損傷。注射用腦蛋白水解物(CH)-Ⅰ是一種從豬腦組織中提取的富含多肽和游離氨基酸的混合物，具有類神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，此類腦組織多肽可以透過血腦屏障，提高神經(jīng)元存活率，調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性，修復(fù)神經(jīng)元〔9，10〕。但是，迄今關(guān)于CH-Ⅰ對腦衰老損傷的作用及可能的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。因此，本研究試圖通過建立D-半乳糖誘導(dǎo)的動物衰老模型，探究CH-Ⅰ防治腦衰老損傷的作用及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1主要試劑 注射用CH-Ⅰ(批號：0190501-1，30 mg/支)購自河北智同生物制藥公司；D-半乳糖(D-gal，批號：K1915124，純度≥99%)購自上海阿拉丁試劑公司；端粒酶PCR-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(1185666910)購自德國羅氏公司；STAT3(AF6294)、磷酸化(p)-STAT3(Tyr705，批號：AF3293)、β-actin(批號：AF7018)抗體購自美國Affinity公司；BDNF(批號：381133)抗體購自成都正能生物技術(shù)公司；TERT抗體(批號：NB100-317)購自美國Novus公司。

1.2主要儀器 酶標(biāo)儀(SYNERGYH1)購自美國Bio-Tek公司；垂直電泳儀(PowerPacTMHC)購自美國Bio-Rad公司；光學(xué)顯微鏡(IX-70)購自日本Olympus公司；PCR儀(T100TM)購自美國Bio-Rad公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性C57/BL6N小鼠(SCXK2016-0006)48只，8周齡，SPF級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司。飼養(yǎng)于青島大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級實(shí)驗(yàn)動物室，溫度控制在23～25℃，自然光照，自由飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CH-Ⅰ低劑量組(3 mg/kg)和CH-Ⅰ高劑量組(6 mg/kg)，每組12只。對照組小鼠頸背部注射生理鹽水，其余小鼠頸背部皮下注射D-gal 150 mg/kg，每天1次，持續(xù)8 w。根據(jù)Nam等〔11〕所述，D-gal給藥3 w后，給藥組小鼠按分組分別給予腹腔注射CH-Ⅰ 3 mg/kg和6 mg/kg，對照組和模型組小鼠腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)5 w。藥物干預(yù)結(jié)束7 d后，使用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測小鼠的學(xué)習(xí)能力。動物實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)要求。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)〔12〕檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。小鼠連續(xù)5 d進(jìn)行隱藏平臺測試，小鼠每天進(jìn)行4次訓(xùn)練，并在第6天進(jìn)行探針試驗(yàn)。在隱藏平臺測試中，小鼠可以在60 s內(nèi)自由到達(dá)隱藏平臺，并允許在平臺上停留30 s。當(dāng)小鼠找到平臺時(shí)，記錄所需時(shí)間，如果小鼠在60 s內(nèi)找不到平臺，將被引到平臺并停留30 s。平臺在第6天被移除，各組小鼠自原平臺對角線象限出發(fā)尋找平臺，記錄找到原平臺所用時(shí)間和在平臺象限停留時(shí)間。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取4只小鼠深度麻醉，經(jīng)心臟灌注0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛，完整取腦〔13〕。腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，自乳頭體后(海馬區(qū))連續(xù)冠狀切片，厚度7 μm，每隔3張抽取1張，貼于多聚賴氨酸處理的切片上。根據(jù)HE試劑盒的說明進(jìn)行染色，海馬切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色3 min，分化液分化10 s，自來水浸泡15 min，伊紅染色1 min，自來水終止顯色。常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察海馬結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核呈藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的紅色。倒置顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)染色情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍(×400)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取其均值。以變性細(xì)胞指數(shù)(DCI=變性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))表示損傷程度。

1.6Western印跡 提取小鼠海馬組織中的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定其蛋白濃度。樣品用十二烷基硫酸鹽-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉(zhuǎn)移到聚偏乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉(1×TBST 配制)室溫封閉2 h。洗膜后加一抗(BDNF 1∶1 000、STAT3 1∶1 000、p-STAT3 1∶1 000、TERT 1∶500、β-actin 1∶1 000)于4℃孵育過夜，洗膜后加二抗(1∶10 000)室溫孵育1.5 h，ECL發(fā)光試劑顯色。使用ImageJ軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的比值。

1.7端粒酶活性檢測 采用端粒酶PCR-ELISA試劑盒檢測端粒酶活性。使用試劑盒自帶的裂解液裂解小鼠海馬組織，將裂解提取物添加到含有端粒酶底物的反應(yīng)混合物中。隨后轉(zhuǎn)移到PCR儀中進(jìn)行延伸和擴(kuò)增，測量方案如下：25℃ 30 min；94℃ 5 min，94℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；50℃ 30 s，72℃ 90 s，72℃ 10 min。RNA酶滅活的提取物作為陰性對照，試劑盒提供的提取物作為陽性對照。將5 μl PCR產(chǎn)物加入25 μl變性試劑和225 μl雜交緩沖液后，向鏈霉親和素預(yù)涂的96孔板中加入100 μl/孔的PCR產(chǎn)物，37℃變性雜交2 h，然后使用抗地高素過氧化物酶結(jié)合物和3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物進(jìn)行ELISA檢測，使用酶標(biāo)儀測定450 nm和690 nm處的吸光度。相對吸光度=樣品吸光度(A450 nm-A690 nm)-陰性對照吸光度(A450 nm-A690 nm)，相對吸光度大于0.2為端粒酶陽性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSDt檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 模型組抵達(dá)平臺所用時(shí)間較對照組顯著延長(P<0.01)，而在平臺象限的停留時(shí)間較對照組明顯縮短(P<0.01)，這提示模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)障礙。與模型組相比，CH-Ⅰ低、高劑量組抵達(dá)原平臺所用時(shí)間較模型組顯著縮短(P<0.05)，在平臺象限停留時(shí)間明顯延長(P<0.01)，并且CH-Ⅰ高劑量組和低劑量組小鼠之間無顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組小鼠在水迷宮探索實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動軌跡

表1 CH-Ⅰ對小鼠抵達(dá)平臺時(shí)間和平臺象限停留時(shí)間的影響

2.2小鼠海馬CA1區(qū)HE染色 對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，核內(nèi)可見明顯核仁；模型組海馬神經(jīng)元出現(xiàn)神經(jīng)元排列無序、松散，細(xì)胞核固縮深染，并有部分形成空洞，DCI(0.58±0.03)較對照組(0.21±0.02)明顯升高(P<0.01)，提示D-gal可導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元發(fā)生病理改變。CH-Ⅰ組小鼠海馬神經(jīng)元損傷較模型組減輕，細(xì)胞排列趨于整齊，少數(shù)細(xì)胞固縮深染；與模型組相比，CH-Ⅰ低劑量組和高劑量組的DCI顯著降低至0.50±0.03(P<0.05)和0.44±0.06(P<0.01)，CH-Ⅰ高、低劑量組之間無顯著性差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 CH-Ⅰ對各組小鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×400)

2.3小鼠海馬組織中TERT的表達(dá)和端粒酶活性 模型組海馬組織中TERT表達(dá)水平(0.18±0.13)較模型組(0.35±0.14)明顯下降(P<0.01)，CH-Ⅰ低、高劑量組海馬組織中TERT表達(dá)較模型組明顯增加(0.25±0.13、0.29±0.15；P<0.05)。與對照組(1.11±0.17)相比，模型組端粒酶活性(0.60±0.13)顯著降低(P<0.01)。而與模型組相比，CH-Ⅰ低、高劑量組端粒酶活性顯著升高(0.72±0.14、0.87±0.15；P<0.05)。CH-Ⅰ高、低劑量組之間無顯著性差異(P>0.05)。見圖3。

1～4:對照組、模型組、CH-Ⅰ低劑量組、CH-Ⅰ高劑量組；下圖同圖3 CH-Ⅰ對各組小鼠海馬組織TERT蛋白表達(dá)的影響

2.4小鼠海馬組織中BDNF、STAT3、p-STAT3的蛋白表達(dá)情況 與對照組(0.77±0.04)相比，模型組海馬組織中BDNF表達(dá)(0.51±0.05)顯著下降(P<0.01)。CH-Ⅰ低、高劑量組海馬組織中BDNF水平(0.65±0.05、0.71±0.04)較模型組均顯著升高(P<0.05)。與對照組(0.69±0.04)相比，模型組p-STAT3水平(0.33±0.03)明顯下降(P<0.01)，CH-Ⅰ低、高劑量組海馬組織中p-STAT3水平(0.48±0.04、0.757±0.05)較模型組均顯著升高(P<0.05)，盡管總STAT3的表達(dá)水平不變。見圖4。

圖4 CH-Ⅰ對各組小鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)和p-STAT3水平的影響

3 討 論

自然衰老是一個(gè)漸進(jìn)的過程，與一系列形態(tài)和行為變化有關(guān)，包括神經(jīng)退行功能障礙，如運(yùn)動和認(rèn)知表現(xiàn)〔14〕。天然活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)可能是延緩大腦衰老的有效干預(yù)措施。長期接觸D-gal會導(dǎo)致類似自然衰老的癥狀〔15〕，因此，D-gal誘發(fā)的衰老模型被廣泛用于抗衰老研究。本研究小鼠學(xué)習(xí)記憶能力結(jié)果與Li等〔16〕的研究結(jié)果相似，表明CH-Ⅰ對D-gal引起的衰老小鼠的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。

端粒酶失活與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔17～19〕，而Jaskelioff等〔20〕研究表明，端粒酶重新激活逆轉(zhuǎn)了大腦的衰老過程，包括神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化、大腦大小和嗅覺功能等〔20〕，因此激活端粒酶已被認(rèn)為是延緩腦衰老的有效方法。TERT是端粒酶的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)節(jié)亞基，作為端粒酶的重要組成部分僅存在于端粒酶陽性細(xì)胞中，而TERT的表達(dá)依賴于多種轉(zhuǎn)錄因子〔21〕。STAT3是一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育、免疫和炎癥等生理過程中發(fā)揮作用〔22〕，可以將生長因子和細(xì)胞因子的信號從細(xì)胞膜傳送到細(xì)胞核上，使其到達(dá)目標(biāo)基因〔23〕。研究表明〔24，25〕，STAT3是TERT重要的激活劑，可以上調(diào)TERT的表達(dá)并提高端粒酶活性。因此STAT3在TERT的表達(dá)和端粒酶激活中發(fā)揮著重要作用。

一些藥物已被證實(shí)可以通過影響端粒酶活性發(fā)揮延緩衰老的作用〔26～28〕。Benito等〔8〕研究表明，增加BDNF和STAT3的磷酸化水平，可以促進(jìn)神經(jīng)再生，改善神經(jīng)損傷，并且通過增加BDNF的表達(dá)和磷酸化STAT3也可以改善大鼠〔29〕的記憶缺陷，本研究表明CH-Ⅰ可顯著提高D-gal衰老小鼠海馬組織中的BDNF表達(dá)水平。CH-Ⅰ改善D-gal誘導(dǎo)衰老小鼠的認(rèn)知功能障礙，減輕衰老小鼠海馬神經(jīng)元的損傷，其作用機(jī)制可能與CH-Ⅰ提高海馬組織中BDNF的表達(dá)水平，并上調(diào)TERT的表達(dá)和STAT3磷酸化水，激活端粒酶的活性有關(guān)。本研究有望對防治神經(jīng)系統(tǒng)衰老損傷及老年相關(guān)性疾病，提供新的途徑和思路。