任敬 陳謙 許建新 楊新宇 吳琦

(天津市泰達(dá)醫(yī)院 1呼吸內(nèi)科，天津 300457；2神經(jīng)外科；3天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科；4天津大學(xué)海河醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科)

肺癌是臨床上最為常見的惡性實(shí)體腫瘤，其發(fā)病率在男性為第一位，女性為第二位，且死亡率位居所有腫瘤的第一位〔1〕。根據(jù)病理類型，肺癌大體分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC約占所有肺癌的80%〔2〕。大部分NSCLC患者就診時(shí)已發(fā)展為晚期或局部晚期，失去根治手術(shù)的時(shí)機(jī)因而預(yù)后較差。然而，NSCLC的發(fā)病機(jī)制仍然不明，其患者預(yù)后相關(guān)因素并不完全清楚。近年來隨著高通量測序等分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，從分子角度探尋NSCLC發(fā)病機(jī)制及預(yù)后相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Fscn)1基因定位于人7號染色體，其生物學(xué)功能主要與細(xì)胞遷移有關(guān)〔3〕。Fscn1基因編碼蛋白在人多種實(shí)體腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，如腸癌、肝癌、前列腺癌等，并與患者的臨床病理特征存在一定的關(guān)系〔4～6〕。但Fscn1基因在NSCLC中的表達(dá)、生物學(xué)功能及其與患者預(yù)后關(guān)系研究鮮有報(bào)道。本研究主要探討Fscn1基因在NSCLC中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1Fscn1基因mRNA在腫瘤及對應(yīng)正常組織中的表達(dá) 在人類腫瘤基因組(TCGA)數(shù)據(jù)庫中檢索“肺癌”“非小細(xì)胞肺癌”和“Fscn1基因”，檢索物種為人類，比較多種人腫瘤組織和對應(yīng)正常組織中Fscn1基因mRNA的表達(dá)水平，存在差異的條件為基因差異表達(dá)大于2倍(|Log2FC|>1)，P<0.05〔7〕。

1.2功能富集和蛋白網(wǎng)絡(luò)分析 采用基因本體論(GO)對Fscn1基因和相關(guān)蛋白進(jìn)行功能富集，包括細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程3個(gè)層面〔8〕。同時(shí)利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.5〔9〕。

1.3生存分析 根據(jù)Fscn1基因在NSCLC患者癌組織中表達(dá)的中位數(shù)，分為高、低表達(dá)組，分別計(jì)算高、低表達(dá)組生存期并繪制生存曲線(Kaplan-Meier)，采用Log-Rank檢驗(yàn)分析比較高、低表達(dá)組與患者預(yù)后的關(guān)系。比較總生存期(OS)和無疾病進(jìn)展生存期(DFS)在Fscn1基因高低表達(dá)組間是否存在差異。

1.4免疫組織化學(xué)法 回顧性分析天津市泰達(dá)醫(yī)院收治的NSCLC患者51例，采用免疫組織化學(xué)法檢測患者手術(shù)標(biāo)本中NSCLC患者癌組織和癌旁正常組織中Fscn1基因編碼蛋白表達(dá)水平，分析比較Fscn1基因編碼蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。免疫組織化學(xué)檢測Fscn1基因編碼蛋白表達(dá)按試劑盒操作說明進(jìn)行。在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)著色強(qiáng)弱和陽性細(xì)胞比例綜合判定Fscn1表達(dá)強(qiáng)度。按色強(qiáng)度評分：不著色(0分)、淺黃(1分)、棕黃(2分)、棕褐色(3分)；按照每高倍鏡(SP，×200)下陽性細(xì)胞所占的比例分為<10%(0分)、10%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)及>75%(4分)。總體評分值=陽性細(xì)胞比例評分×染色強(qiáng)度評分；最終評判：<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。低表達(dá)率(%)=低表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。高表達(dá)率=高表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用STATA12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Log-Rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Fscn1在NSCLC和其他腫瘤中的表達(dá) 與正常肺組織比較，F(xiàn)scn1基因mRNA在多種腫瘤中表達(dá)水平明顯升高，見圖1A；在肺鱗癌患者中，癌組織中Fscn1基因mRNA表達(dá)水平顯著高于正常肺組織(P<0.05)，見圖1B；進(jìn)一步分析顯示，NSCLC不同臨床分期患者Fscn1基因mRNA表達(dá)水平存在明顯差異 (P<0.05)，見圖1c。

1)P<0.05A:Fscn1基因mRNA在多種腫瘤及對應(yīng)正常組織中的表達(dá)；B Fscn1基因mRNA在肺腺癌和鱗癌及對應(yīng)正常組織中的表達(dá)；C:Fscn1基因mRNA表達(dá)與NSCLC患者臨床分期的關(guān)系BLCA:膀胱尿路上皮癌；BRCA:乳腺浸潤癌；CESC:宮頸鱗癌和腺癌；CHOL:膽管癌；COAD:結(jié)腸癌；ESCA:食管癌；GBM:多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤；HNSC:頭頸鱗狀細(xì)胞癌；KICH:腎嫌色細(xì)胞癌；KIRC:腎透明細(xì)胞癌；KIRP:腎乳頭狀細(xì)胞癌；LIHC:肝細(xì)胞肝癌；LUAD:肺腺癌；LUSC:肺鱗癌；PAAD:胰腺癌；PRAD:前列腺癌；PCPG:嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤；READ:直腸腺癌；SARC:肉瘤；SKCM:皮膚黑色素瘤；THCA:甲狀腺癌；THYM:胸腺癌；STAD:胃癌；UCEC:子宮內(nèi)膜癌圖1 Fscn1基因mRNA在NSCLC和其他腫瘤中表達(dá)

2.2Fscn1基因編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 與Fscn1基因編碼蛋白相互作用較為緊密的蛋白網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)數(shù)共51個(gè)，相互作用關(guān)系446個(gè)，區(qū)域聚類指數(shù)為0.75，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)富集顯著(P<0.05)。見圖2。

圖2 與Fscn1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3功能富集

2.3.1Fscn1基因生物學(xué)過程富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白生物學(xué)過程主要富集于核小體組裝，間充質(zhì)細(xì)胞遷移和胸腺細(xì)胞凋亡等，見圖3。

圖3 生物學(xué)過程富集氣泡圖

2.3.2Fscn1基因細(xì)胞成分富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白細(xì)胞主要富集于核小體、肌球蛋白束和肌動(dòng)蛋白等，見圖4。

圖4 細(xì)胞成分富集氣泡圖

2.3.3Fscn1基因分子功能富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白細(xì)胞主要富集于 ATP酶活性、黏附鏈接、蛋白結(jié)合等，見圖5。

圖5 分子功能富集氣泡圖

2.3.4Fscn1基因相關(guān)信號通路富集 Fscn1基因及其相互作用蛋白KEGG信號通路主要富集于細(xì)胞間緊密連接、胰腺腫瘤和上皮細(xì)胞侵襲等，見圖6。

圖6 KEGG信號通路富集氣泡圖

2.4相關(guān)分析 相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)scn1基因正相關(guān)表達(dá)最顯著的基因?yàn)镾PHK1基因(r=0.53);于Fscn1基因負(fù)相關(guān)表達(dá)最顯著的基因?yàn)榭缒さ鞍?TMEM)125(r=-0.38)，見圖7。

A:正相關(guān)表達(dá)基因SPHK1;B:負(fù)相關(guān)表達(dá)基因TMEM125 圖7 Fscn1基因相關(guān)表達(dá)基因散點(diǎn)圖

2.5生存分析 根據(jù)Fscn1基因mRNA在NSCLC患者癌組織中表達(dá)的中位數(shù)分為高低表達(dá)組，生存分析顯示高低表達(dá)組總生存(HR=1.3,P<0.05)顯著低于低表達(dá)組；但高低表達(dá)組患者無疾病進(jìn)展生存無明顯差異(HR=0.82,P>0.05)，見圖8。

圖8 Fscn1 mRNA在NSCLC患者中表達(dá)與患者生存期關(guān)系

進(jìn)一步根據(jù)病理類型分為鱗癌和腺癌，結(jié)果顯示肺腺癌中，F(xiàn)scn1基因mRNA高表達(dá)患者總生存期顯著低于低表達(dá)者(HR=1.6,P<0.05)。

2.6Fscn1基因編碼蛋白表達(dá)情況 Fscn1基因編碼蛋白主要表達(dá)于肺癌細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒狀，彌漫分布于細(xì)胞膜及細(xì)胞包質(zhì)內(nèi)。Fscn1基因編碼蛋白在NSCLC患者癌和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為70.6%(36/51)和17.6%(9/51)。Fscn1基因編碼蛋白在NSCLC患者癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

2.7Fscn1基因編碼蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系 Fscn1基因編碼蛋白在癌組織中的陽性表達(dá)與NSCLC患者的臨床分期(P<0.05)和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 Fscn1基因編碼蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征關(guān)系(n)

3 討 論

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，2018年北美肺癌發(fā)病人數(shù)23萬人，死亡人數(shù)為15萬人〔10〕。在我國，肺癌是導(dǎo)致居民死亡的重要原因之一，每年因肺癌死亡的人數(shù)高達(dá)數(shù)十萬人，肺癌早期起病隱匿，往往在診斷時(shí)處于轉(zhuǎn)移性Ⅳ期并伴有遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，這導(dǎo)致了患者總生存期縮短，其中腦轉(zhuǎn)移占很大比例〔11〕。然而肺癌的發(fā)病原因目前仍未完全明了，大多數(shù)研究認(rèn)為與患者的遺傳背景和后天環(huán)境因素有關(guān)。遺傳背景包括惡性腫瘤家族史、某些代謝酶基因多態(tài)性等〔12〕，后天因素主要與吸煙、環(huán)境污染等因素有關(guān)。但肺癌發(fā)生的機(jī)制十分復(fù)雜，其確切發(fā)病分子機(jī)制仍不完全明了。近年來隨著高通量測序等分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，從分子角度探尋NSCLC發(fā)病機(jī)制及預(yù)后相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)。

有文獻(xiàn)報(bào)道Fscn1基因編碼蛋白在多種實(shí)體腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，如結(jié)直腸癌、肝癌、旁觀愛等，并與患者的臨床病理特征和預(yù)后存在一定的關(guān)系〔6〕。Fscn1基因編碼蛋白是一種細(xì)胞骨架蛋白，該基因主要是與F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合，并將其組裝成平行排列的肌動(dòng)蛋白束，是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵基因之一〔13〕。人類的Fascin基因定位染色體于7p22，編碼一個(gè)分子量為55 kU的細(xì)胞骨架蛋白，F(xiàn)asci蛋白單體有2個(gè)位點(diǎn)可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，每2個(gè)單體可倒置形成二聚體，每個(gè)二聚體按1∶4比例與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，使肌動(dòng)蛋白形成蛋白纖維間距離為8 nm的有序的平行束結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有利于加強(qiáng)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架以利于抵抗由于細(xì)胞遷移時(shí)細(xì)胞突起運(yùn)動(dòng)引起的細(xì)胞膜延伸，從而對細(xì)胞移動(dòng)起著重要作用〔14〕。因此，該基因高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的遷移有關(guān)。Puppa等〔15〕分析晚期結(jié)腸癌患者腫瘤組織中Fscn1基因編碼蛋白表達(dá)及其與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)scn1基因高表達(dá)與腫瘤的浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究提示Fscn1基因可能在NSCLC的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)可能增加。因此，F(xiàn)scn1基因在肺癌中表達(dá)水平明顯上調(diào)，且可能參與了肺癌的轉(zhuǎn)移過程。通過靶向一致Fscn1基因表達(dá)，有望成為NSCLC治療的新靶點(diǎn)。