高虹 焦宏偉 貝寧 葉苗苗

(海南省干部療養(yǎng)院 海南省老年病醫(yī)院內(nèi)科，海南 ?？?571100)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥之一，足細(xì)胞在DN的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，高糖導(dǎo)致足細(xì)胞肥大、脫落和凋亡，足細(xì)胞裂孔膜蛋白nephrin和podocin表達(dá)下調(diào)，產(chǎn)生蛋白尿〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)志皂苷(TEN)對(duì)Aβ140引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性〔2〕、大鼠心肌缺血再灌注損傷〔3〕及過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷〔4〕有明顯的保護(hù)作用。但具體機(jī)制尚不清楚。miR-325-3p在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中miR-325-3p表達(dá)下調(diào)，叔丁基對(duì)苯二酚通過(guò)上調(diào)miR-325-5p表達(dá)對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜起保護(hù)作用〔5〕。本研究通過(guò)StarBase預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，GADD45B可能是miR-325-5p的靶基因。GADD45B是DNA損傷修復(fù)的重要相關(guān)基因家族成員之一，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β刺激引起的足細(xì)胞損傷中上調(diào)表達(dá)〔6〕。本研究假設(shè)遠(yuǎn)志皂苷通過(guò)調(diào)控miR-325-3p/GADD45B通路影響高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷，以小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞損傷為模型，并對(duì)此假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠永生性腎臟足細(xì)胞系MPC5購(gòu)自ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TEN(純度98.5%)購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；干擾素(IFN)-γ、鼠尾膠原蛋白Ⅰ、胰蛋白酶Trypsin購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；抗GADD45B抗體、抗podocin抗體、抗nephrin抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、總RNA提取試劑Trizol、 實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；miR-325-3p模擬物(miR-325-3p)/miR-325-3p抑制劑(anti-miR-325-3p)、陰性對(duì)照(miR-NC和anti-miR-NC)、GADD45B的野生型(WT-GADD45B)和突變型(MUT-GADD45B)雙熒光報(bào)告載體購(gòu)自上海吉瑪基因；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、分化和分組〔7〕細(xì)胞培養(yǎng)和分化：將MPC5在含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素及10 U/ml IFN-γ的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置33℃ 5%CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞基本融合為一層時(shí)，收集細(xì)胞，將傳代的MPC5細(xì)胞轉(zhuǎn)入瓶底鋪有0.1 mg/ml的鼠尾膠原蛋白Ⅰ分化培養(yǎng)液中，37℃ 5%CO2、濕度95%的條件下培養(yǎng)12～14 d，細(xì)胞分化成熟。

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照(NG)組：RPMI1640培養(yǎng)基+D-葡萄糖5 mmol/L；高糖刺激(HG)組：RPMI1640培養(yǎng)基+D-葡萄糖30 mmol/L；高糖刺激+TEN(HG+TEN)組：RPMI1640培養(yǎng)基+D-葡萄糖30 mmol/L+TEN 50、100 或200 μmol/L即為HG+TEN-L組、HG+TEN-M組、HG+TEN-H組；高糖刺激+轉(zhuǎn)染(HG+轉(zhuǎn)染)組：轉(zhuǎn)染48 h后用RPMI1640培養(yǎng)基+D-葡萄糖30 mmol/L進(jìn)行處理24 h；高糖刺激+TEN+轉(zhuǎn)染(HG+TEN+轉(zhuǎn)染)組：轉(zhuǎn)染48 h后用RPMI1640培養(yǎng)基+D-葡萄糖30 mmol/L+TEN 200 μmol/L進(jìn)行處理24 h。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將MPC5以每孔4×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：miR-325-3p過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-325-3p，以miR-NC為對(duì)照)，miR-325-3p抑制組(轉(zhuǎn)染anti-miR-325-3p，以anti-miR-NC為對(duì)照)，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)組(轉(zhuǎn)染miR-325-3p+WT-GADD45B、miR-NC+WT-GADD45B、miR-325-3p+MUT-GADD45B或miR-325-3p+WT-GADD45-B)。將無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋的等體積脂質(zhì)體和各組載體混合，室溫孵育20 min，加入培養(yǎng)好的細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h，棄無(wú)血清培養(yǎng)液，加入RPMI1640完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)miR-325-3p和GADD45B mRNA的表達(dá) 收集各組MPC5細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA為模板按照qRT-PCR的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)合成miR-325-3p和GADD45B mRNA，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；94℃ 30 s、59℃ 40 s、72℃ 45 s，42個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組MPC5細(xì)胞，加入放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液裂解細(xì)胞，然后進(jìn)行超聲破碎，收集細(xì)胞中的蛋白，測(cè)定總蛋白濃度。將蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入稀釋的各個(gè)一抗(GADD45B抗體1∶1 000、podocin抗體1∶1 000、nephrin抗體1∶1 000、Bcl-2抗體1∶2 000、Bax抗體1∶3 000和GAPDH抗體1∶4 000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜2次，加入稀釋的酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，以GAPDH 為內(nèi)參。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 收集經(jīng)葡萄糖或(和)TEN處理或轉(zhuǎn)染后各組MPC5細(xì)胞，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，按照膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，混勻，室溫避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.2進(jìn)行MPC5細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的PRMT5的野生型(WT-PRMT5)和突變型(MUT-PRMT5)雙熒光素酶報(bào)告載體分別與miR-NC或miR-188-5p共轉(zhuǎn)染MPC5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，離心收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TEN對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中podocin和nephrin蛋白表達(dá)的影響 與NG組相比，HG組podocin和nephrin 蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+TEN-L組、HG+TEN-M組和HG+TEN-H組的podocin和nephrin蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，呈濃度依賴趨勢(shì)均(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。說(shuō)明TEN可以促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中podocin和nephrin的表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷。

1～5：NG組，HG組，HG+TEN-L組，HG+TEN-M組，HG+TEN-H組，下圖同圖1 Western印跡檢測(cè)podocin和nephrin蛋白表達(dá)

2.2TEN對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡的影響 與NG組相比，HG組MPC5細(xì)胞凋亡率和Bax水平顯著上升(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+TEN-L組、HG+TEN-M組和HG+TEN-H組足細(xì)胞凋亡率和Bax水平顯著下降(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，呈濃度依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2、圖3。說(shuō)明高糖促進(jìn)小鼠足細(xì)胞凋亡，TEN抑制了高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡。

圖2 TEN對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3TEN對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中miR-325-3p和GADD45B表達(dá)的影響 與NG組相比，HG組MPC5細(xì)胞中miR-325-3p表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，GADD45B mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與HG組相比，HG+TEN-L組、HG+TEN-M組和HG+TEN-H組足細(xì)胞中miR-325-3p表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，GADD45B mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，呈濃度依賴性(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖4。說(shuō)明高糖可下調(diào)小鼠足細(xì)胞miR-325-3p水平并上調(diào)GADD45B水平，TEN逆轉(zhuǎn)了這一作用。

圖4 Western印跡檢測(cè)GADD45B蛋白表達(dá)

2.4miR-325-3p靶向調(diào)控GADD45B的表達(dá) 通過(guò)StarBas預(yù)測(cè)顯示，GADD45B的3′UTR序列中含有與miR-325-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖5。與miR-NC組相比，miR-325-3p組GADD45B野生型WT-GADD45B熒光素酶相對(duì)活性顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT-GADD45B熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)表2。miR-325-3p組GADD45B蛋白(0.22±0.03)顯著低于miR-NC組(0.41±0.04，P<0.05)；anti-miR-325-3p組GAPD-45B蛋白(0.83±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.38±0.03，P<0.05)。見(jiàn)圖6。說(shuō)明miR-325-3p靶向負(fù)調(diào)控GADD45B的表達(dá)。

圖5 GADD45B的3′UTR中含有與miR-325-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

1～4：miR-NC組，miR-325-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-325-3p組圖6 Western印跡檢測(cè)各組GADD45B水平

2.5miR-325-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-325-3p組MPC5細(xì)胞中miR-325-3p、podocin、nephrin和Bcl-2水平顯著上升(P<0.05)，GADD45B、Bax蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖7、圖8。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-325-3p可抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞MPC5損傷，并抑制細(xì)胞凋亡。

1～2：HG+miR-NC組，HG+miR-325-3p組圖7 Western印跡檢測(cè)GADD45B、podocin、nephrin及凋亡蛋白水平

圖8 miR-325-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的影響

2.6抑制miR-325-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了TEN(200 μmol/L)對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的作用 與HG+TEN+anti-miR-NC組相比，HG+TEN+anti-miR--325-3p組miR-325-3p、podocin、nephrin和Bcl-2含量顯著下降(P<0.05)，GADD45B、Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖9、表4。

1，2：HG+TEN+anti-miR-NC組，HG+TEN+anti-miR-325-3p組圖9 抑制miR-325-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了TEN對(duì)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

TEN是中藥遠(yuǎn)志的活性成分之一，具有祛痰鎮(zhèn)咳、益智、保護(hù)心腦血管、抗老年癡呆等功能〔8〕。目前針對(duì)TEN的主要研究集中在抗老年癡呆、益智等方面。研究表明，在2型糖尿病和阿爾茨海默病(AD)小鼠模型中，TEN可改善小鼠記憶障礙，調(diào)控2型糖尿病小鼠的血糖和血脂，具有益智和降糖作用〔9〕。本研究結(jié)果說(shuō)明TEN對(duì)足細(xì)胞具有潛在的臨床保護(hù)作用。

生長(zhǎng)阻滯和GADD45B是GADD45基因家族中的一員，參與細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞存活或凋亡及DNA損傷修復(fù)等過(guò)程〔10〕。研究表明GADD45B在斑馬魚(yú)足細(xì)胞損傷模型中表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)激活ROS-GADD45B-p38通路加重水腫、蛋白尿和足突消退，敲除GADD45B可改善足細(xì)胞損傷〔11〕。雷公藤內(nèi)酯醇通過(guò)抑制p53-NF-κB/GADD45B信號(hào)傳導(dǎo)而減輕蛋白尿和足細(xì)胞凋亡，GADD45B在斑馬魚(yú)足細(xì)胞中的特異性過(guò)表達(dá)消除了雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用〔12,13〕。

miR-325-3p在非小細(xì)胞肺癌和乙型肝炎型肝細(xì)胞癌中表達(dá)異常，與癌癥的進(jìn)展和化療耐藥性有關(guān)〔14,15〕。本研究結(jié)果說(shuō)明TEN確實(shí)通過(guò)調(diào)控miR-325-3p發(fā)揮對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用。