劉晶 王景 葛靜 王旭 馮艷萍 房桂英 李林

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050031)

外泌體富含DNA、RNA、蛋白質(zhì)等多種成分，在免疫反應(yīng)、細(xì)胞通訊、血管生成、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用；血液、唾液、腹腔積液、胸水、尿液等體液中均可分離出外泌體，故外泌體在人體內(nèi)分布比較廣泛〔1〕。外泌體在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視，各種來(lái)源的外泌體可產(chǎn)生特異性惡性腫瘤相關(guān)的mRNA、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)，并可將這些活性物質(zhì)傳遞給免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等，通過(guò)改變受體細(xì)胞蛋白功能達(dá)到促進(jìn)惡性腫瘤增殖、凋亡、侵襲遷移等目的〔2,3〕。外泌體在宮頸癌中的作用也受到大家關(guān)注，易紅艷等〔4〕采用差速超離心法分離宮頸癌細(xì)胞Siha細(xì)胞外泌體，并發(fā)現(xiàn)其可介導(dǎo)宮頸癌前細(xì)胞Ect1發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而提高Ect1細(xì)胞的體外侵襲能力。但宮頸癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體在宮頸癌增殖凋亡中的作用及其可能作用機(jī)制尚不十分清楚。絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)信號(hào)通路為細(xì)胞內(nèi)重要的促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路之一〔5〕，可通過(guò)影響其下游的細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白的活性，在宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用〔6〕。本研究旨在探討宮頸癌C33A細(xì)胞外泌體對(duì)其自身增殖凋亡影響的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系、主要試劑及儀器 人宮頸癌C33A細(xì)胞系(ATCC細(xì)胞庫(kù))，F(xiàn)KH-67染劑、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒、DAPI、Alex Fluro 594 Phalloidin(美國(guó)Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)基、KGM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；兔抗人CD81抗體、兔抗人CD63抗體、兔抗人ERK1/2多克隆抗體、兔抗人磷酸化(p)ERK1/2多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；JEM-1400透射電子顯微鏡(日本電子公司)；共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2方法

1.2.1人宮頸癌C33A細(xì)胞培養(yǎng) C33A細(xì)胞復(fù)蘇后，用RPMI1640(含青霉素和鏈霉素)的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，C33A細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，更換無(wú)血清KGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d換液1次，收集上清液用于提取外泌體。

1.2.2C33A細(xì)胞外泌體的提取和鑒定 將上述收集的C33A細(xì)胞上清液離心(300 r/min)5 min，去掉死亡細(xì)胞，再離心(2 000 r/min)20 min，再離心(10 000 r/min)30 min，將離心得到的上清液進(jìn)行濃縮，在濃縮上清液中加入總外泌體分離試劑過(guò)夜孵育，離心(10 000 r/min)60 min，用PBS重懸沉淀，用磷鎢酸負(fù)染。透射電鏡下拍照并觀察分泌的外泌體形態(tài)；并用Western印跡測(cè)定分泌外泌體CD63和CD81蛋白表達(dá)情況。

1.2.3C33A細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取實(shí)驗(yàn) 將C33A細(xì)胞接種到共聚焦培養(yǎng)皿中(接種密度為1×104個(gè)/ml)常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入PKH67(2 μg)標(biāo)記外泌體，培養(yǎng)48 h后用PBS液清洗，多聚甲醛(4%)固定10 min，Triton透化10 min增加通透性，加入牛血清白蛋白(BSA)孵育30 min降低染色背景，加入Alex Fluro 594 Phalloidin染色細(xì)胞骨架中的F-actin，加入DAPI染色細(xì)胞核，共聚焦顯微鏡下拍照并觀察C33A細(xì)胞對(duì)外泌體的攝取情況。

1.2.4C33A細(xì)胞分組 將C33A細(xì)胞分為外泌體(Exo)組和對(duì)照(C)組，Exo組C33A細(xì)胞中加入含10 μl外泌體的RPMI1640培養(yǎng)基，C組C33A細(xì)胞中加入含等量PBS的培養(yǎng)基〔7〕，收集培養(yǎng)24 h細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.5MTT測(cè)定C33A細(xì)胞增殖能力 將Exo組和C組C33A細(xì)胞接種到96孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)1 d、3 d、5 d加入5 g/L MTT染色，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清液，加入DMSO 150 μl震蕩均勻，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處吸光度(A)值。

1.2.6克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定C33A細(xì)胞集落形成能力 將Exo組和C組C33A細(xì)胞平鋪于6孔板中，每孔300個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2 w，棄去培養(yǎng)基，甲醇固定30 min，結(jié)晶紫(0.4%)染色15 min，拍照并統(tǒng)計(jì)每孔集落形成數(shù)量。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定C33A細(xì)胞凋亡能力 將Exo組和C組C33A細(xì)胞接種到6孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，分別加入Annexin-V 5 μl和PI 5 μl混勻，反應(yīng)15 min，加入緩沖液400 μl，流式細(xì)胞儀檢測(cè)C33A細(xì)胞凋亡情況。其中左下象限為活細(xì)胞；右上象限為壞死細(xì)胞；右下象限為凋亡細(xì)胞。

1.2.8Western印跡測(cè)定C33A細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平 將Exo組和C組C33A細(xì)胞中加入RIPA裂解液，提取總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行定量測(cè)定，每組取40 μg總蛋白進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入兔抗人ERK1/2多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗人p-ERK1/2多克隆抗體(1∶1 000)過(guò)夜孵育，以β-actin為內(nèi)參，加入二抗(1∶15 000)孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，暗室曝光顯影，Image J軟件分析蛋白水平，ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平=ERK1/2、p-ERK1/2條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1C33A細(xì)胞來(lái)源外泌體鑒定 超速離心法富集C33A細(xì)胞外泌體，透射電鏡下見(jiàn)外泌體直徑40～140 nm，呈類(lèi)圓形囊泡結(jié)構(gòu)；Western印跡檢測(cè)見(jiàn)C33A細(xì)胞來(lái)源囊泡狀小體中富含CD63和CD81蛋白，表明C33A細(xì)胞中分離的囊泡狀小體為外泌體，見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 電鏡下觀察C33A細(xì)胞來(lái)源囊泡狀小體形態(tài)

圖2 Western印跡測(cè)定外泌體中CD63、CD81蛋白水平

2.2C33A細(xì)胞攝取外泌體情況 激光掃描共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)：外泌體作用C33A細(xì)胞72 h后，細(xì)胞骨架中的F-actin被Alex Fluro 594 Phalloidin染色為紅色；細(xì)胞核被DAPI染色為藍(lán)色；被PKH67標(biāo)記的外泌體呈綠色熒光，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，主要在細(xì)胞核周?chē)植?，且?guī)缀跛蠧33A細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光，表明C33A細(xì)胞來(lái)源的外泌體可被C33A細(xì)胞攝取。見(jiàn)圖3。

圖3 免疫熒光測(cè)定C33A細(xì)胞攝取外泌體情況(×400)

2.3外泌體對(duì)C33A細(xì)胞增殖能力的影響 1 d、3 d、5 d，Exo組C33A細(xì)胞A值明顯高于C組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組C33A細(xì)胞A值比較

2.4外泌體對(duì)C33A細(xì)胞集落形成數(shù)的影響 Exo組C33A細(xì)胞集落形成數(shù)明顯高于C組(P<0.001)，見(jiàn)圖4、表2。

圖4 克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定C33A細(xì)胞集落形成能力

表2 各組C33A細(xì)胞集落形成數(shù)和細(xì)胞凋亡率比較

2.5外泌體對(duì)C33A細(xì)胞凋亡能力的影響 Exo組C33A細(xì)胞凋亡率明顯低于C組(P<0.001)，見(jiàn)表2、圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定C33A細(xì)胞凋亡能力

2.6外泌體對(duì)C33A細(xì)胞MAPK/ERK信號(hào)通路的影響 兩組C33A細(xì)胞ERK1/2蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Exo組C33A細(xì)胞p-ERK1/2蛋白水平明顯高于C組(P<0.001)，見(jiàn)表3、圖6。

表3 各組C33A細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平比較

圖6 Western印跡測(cè)定各組C33A細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白水平

3 討 論

外泌體合成的第一步為細(xì)胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷形成內(nèi)體，內(nèi)體的膜結(jié)構(gòu)向內(nèi)凹陷，胞質(zhì)RNA和蛋白被選擇性裝進(jìn)內(nèi)部囊泡，形成多泡體，多泡體和細(xì)胞膜相融合，釋放外泌體〔8〕。外泌體可能通過(guò)內(nèi)吞、直接融合、通過(guò)外泌體表明蛋白結(jié)合三種方式作用于靶細(xì)胞〔9〕。外泌體雖可被多數(shù)細(xì)胞分泌，但在癌癥等病理?xiàng)l件下外泌體的釋放增加，其在惡性腫瘤微環(huán)境中的含量尤其豐富，外泌體可介導(dǎo)細(xì)胞之間交流，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體常攜帶有惡性腫瘤抗原，并且外泌體內(nèi)的RNA和蛋白質(zhì)等具有生物學(xué)功能，這些RNA和蛋白質(zhì)傳遞到效應(yīng)細(xì)胞中，在惡性腫瘤的增殖、凋亡及侵襲遷移中發(fā)揮重要作用〔10,11〕。研究發(fā)現(xiàn)外泌體在惡性腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，如乳腺癌細(xì)胞的外泌體在可促進(jìn)CD133+癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡〔12〕；癌細(xì)胞來(lái)源外泌體可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡〔13〕；巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖〔14〕。本研究結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞來(lái)源外泌體在其自身增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。

MAPK/ERK信號(hào)通路為促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的主要通路之一〔15〕，磷酸化激活的ERK(p-ERK)可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，使細(xì)胞周期蛋白D1水平升高，是細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，從而增加宮頸癌細(xì)胞的增殖能力〔16,17〕。p-ERK對(duì)細(xì)胞凋亡終末效應(yīng)器半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的活性具有直接抑制作用，對(duì)各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有阻斷作用〔18〕；p-ERK還可通過(guò)活化細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑IAPs等抑制凋亡分子間接抑制caspase-3活性，進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展〔19〕。外泌體可通過(guò)多種信號(hào)通路參與惡性腫瘤的增殖凋亡過(guò)程〔20〕，如Chen等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，引發(fā)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)。Qu等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體在體外和體內(nèi)可通過(guò)MAPK/ERK通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖。上述研究提示MAPK/ERK在宮頸癌的增殖凋亡中發(fā)揮重要作用，外泌體可通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路參與惡性腫瘤的增殖凋亡過(guò)程，由此推測(cè)MAPK/ERK信號(hào)通路可能參與外泌體影響宮頸癌增殖凋亡的過(guò)程。本研究結(jié)果表明宮頸癌C33A細(xì)胞來(lái)源外泌體可激活宮頸癌C33A細(xì)胞中MAPK/ERK信號(hào)通路，宮頸癌C33A細(xì)胞來(lái)源外泌體可能通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)其自身增殖、抑制其凋亡。