林西西， 王麗可， 萬(wàn)錦貽， 張維溪， 趙偉

抑制G蛋白偶聯(lián)受體40通過(guò)RhoA/ROCK1信號(hào)通路緩解小鼠過(guò)敏性哮喘*

林西西1， 王麗可2， 萬(wàn)錦貽2， 張維溪2， 趙偉3△

［1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，育英兒童醫(yī)院藥劑科，浙江 溫州 325027；2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，育英兒童醫(yī)院兒童變態(tài)反應(yīng)（過(guò)敏）與免疫科，浙江 溫州 325027；3溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325027］

探究抑制G蛋白偶聯(lián)受體40（GPR40）減輕過(guò)敏性哮喘小鼠癥狀的作用及機(jī)制。將28只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組（用卵清蛋白建立過(guò)敏性哮喘模型）、低劑量GPR40抑制劑DC260126干預(yù)組（3 mg/kg DC260126組）和高劑量DC260126干預(yù)組（10 mg/kg DC260126組），每組7只。通過(guò)小鼠肺功能儀檢測(cè)各組小鼠氣道高反應(yīng)性；對(duì)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）炎癥細(xì)胞分類并予以計(jì)數(shù)；肺組織切片進(jìn)行HE染色評(píng)估炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度和炎癥評(píng)分；Western blot檢測(cè)肺組織中GPR40、GTP-RhoA和Rho相關(guān)激酶1（ROCK1）蛋白表達(dá)水平。與哮喘模型組相比，10 mg/kg DC260126組小鼠氣道阻力顯著降低（<0.05），BALF中的炎癥細(xì)胞顯著減少（0.05），肺組織嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少（0.01），肺組織中GTP-RhoA和ROCK1蛋白水平顯著降低（0.01）。抑制GPR40可能通過(guò)Rho/ROCK1信號(hào)通路減輕小鼠過(guò)敏性哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。

哮喘；G偶聯(lián)受體蛋白40；Rho/ROCK1信號(hào)通路；氣道高反應(yīng)性

哮喘是一種嚴(yán)重的慢性異質(zhì)性氣道炎癥性疾病，其核心特征包括氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，AHR）、可逆性氣道阻塞和氣道重塑［1］。目前，使用皮質(zhì)類固醇抑制氣道炎癥，或聯(lián)合支氣管舒張劑和抗膽堿能藥物緩解氣道狹窄是哮喘治療的主流［2］。雖然哮喘對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療的反應(yīng)一般較好，但是仍有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)嚴(yán)重和（或）持續(xù)的癥狀［3］。世界許多地區(qū)的哮喘患病率仍在增加，全世界大約有3億哮喘患者［4］。因此，迫切需要尋找能夠有效延緩哮喘進(jìn)展和避免哮喘發(fā)作的藥物。

G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein-coupled receptors，GPCRs）是構(gòu)成人類最大藥物靶點(diǎn)家族的7次跨膜受體［5］。大量臨床試驗(yàn)提供了GPCR靶向治療途徑治療哮喘的安全性和有效性［6］。G蛋白偶聯(lián)受體40（G-protein-coupled receptor 40，GPR40）又名游離脂肪酸受體1（free fatty acid receptor-1，F(xiàn)FAR-1），是以短鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸為配體的一種孤兒GPCR［7］。Mizuta等［8］鑒定了GPR40在氣道平滑肌中的表達(dá)。GPR40激活會(huì)引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高［9］，然而Ca2+濃度升高會(huì)引起氣道平滑肌收縮。氣道平滑肌過(guò)強(qiáng)的收縮是氣道高反應(yīng)性的主要表現(xiàn)之一［10］。有研究顯示，GPR40激活可引起氣道平滑肌收縮，引起人氣道平滑肌細(xì)胞增殖［11］。氣道平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖是支氣管哮喘的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)之一?；谶@些事實(shí)，GPR40很可能在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，因此可能是一個(gè)潛在和有效的哮喘治療靶點(diǎn)。

RhoA是Rho家族的小GTP酶的成員，可以通過(guò)GDP-RhoA（非活動(dòng)狀態(tài)）和GTP-RhoA（活動(dòng)狀態(tài)）交替轉(zhuǎn)換，發(fā)揮其分子開(kāi)關(guān)的作用［12］。RhoA蛋白下游信號(hào)分子——Rho相關(guān)激酶（Rho-associated kinase，ROCK）與Rho蛋白共同參與調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的黏附、增殖和分化［13］。重要的是，RhoA/ROCK1信號(hào)通路與哮喘的病理生理過(guò)程密切相關(guān)［14］。抑制RhoA/ROCK1信號(hào)通路可減輕氣道平滑肌收縮、氣道重塑和氣道高反應(yīng)性［15-16］。因此，阻斷RhoA/ROCK1信號(hào)通路可能是哮喘治療的潛在干預(yù)措施。

本研究對(duì)卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠腹腔注射GPR40小分子抑制劑DC260126，評(píng)估其呼吸道癥狀、肺部炎癥及病理變化情況，從而探討GPR40是否通過(guò)Rho/ROCK1通路減輕過(guò)敏性哮喘小鼠氣道炎癥和AHR。

材料和方法

1　材料

1.1動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雄性，6～8周齡，體重（20±2） g，購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0002］，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房。所有動(dòng)物飼養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前，小鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2藥品試劑與儀器DC260126購(gòu)于MedChemExpress；OVA購(gòu)于Sigma；RhoA和ROCK1抗體購(gòu)于Abcam，GPR40抗體購(gòu)于Affinity；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)和酶標(biāo)儀均購(gòu)自Bio-Rad。

2　方法

2.1動(dòng)物分組及模型建立將28只SPF級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組（每組7只）：正常對(duì)照（control）組：給予生理鹽水；哮喘模型（OVA）組：用OVA建立過(guò)敏性哮喘模型，霧化激發(fā)前用生理鹽水；低劑量DC260126組（3 mg/kg DC260126組）和高劑量DC260126組（10 mg/kg DC260126組）：用OVA建立過(guò)敏性哮喘模型，霧化激發(fā)前分別用3 mg/kg和10 mg/kg DC260126進(jìn)行腹腔注射。過(guò)敏性哮喘模型的建立是參照先前的研究［17］。OVA組、3 mg/kg DC260126組和10 mg/kg DC260126組小鼠在第0天和第14天腹腔注射0.1 mL致敏液（含有OVA 10 μg和氫氧化鋁20 mg的生理鹽水混合液），以達(dá)到致敏效果，control組注射等體積生理鹽水。從第21～28天以含1% OVA的生理鹽水每天進(jìn)行霧化激發(fā)，每次30 min；control組使用生理鹽水。DC260126治療組在霧化激發(fā)前0.5 h分別腹腔注射不同濃度的DC260126，其濃度的選擇參考Sun等［18］的研究方法，control組和OVA組腹腔注射等體積、同比例的DMSO生理鹽水混合液，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Establishment of allergic asthma mouse model. OVA： ovalbumin； Alum： aluminum hydroxide adjuvant.

2.2氣道高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，AHR）測(cè)定末次激發(fā)后24 h內(nèi)，用1 %戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠。使用濃度分別為 3.125、6.25、12.5、25和50 g/L呈濃度梯度的乙酰甲膽堿（methacholine，MCh）對(duì)小鼠進(jìn)行霧化10 s，并且測(cè)定依次氣道阻力（air way resistance，aw）和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（dynamic compliance，dyn），再分別計(jì)算各濃度上的aw和dyn與基線的百分比。

2.3支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的制備和細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)扎左肺，用含1%牛血清白蛋白和5 000 U/L肝素的PBS 0.5 mL灌洗右肺3次，獲得BALF。在光鏡下計(jì)算BALF中總細(xì)胞數(shù)。1 000×離心10 min，收集細(xì)胞涂片進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，光鏡下分類計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞，結(jié)果表示為×107L-1。

2.4肺組織病理學(xué)檢查小鼠的肺組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片厚度為3～4 μm。按照HE染色試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行HE染色。光鏡下半定量判定肺部炎癥嚴(yán)重程度：無(wú)炎癥細(xì)胞（0分）；少許炎癥細(xì)胞（1分）；較多分布不均的炎癥細(xì)胞（2分）；大量炎癥細(xì)胞，分布較均勻，少見(jiàn)聚集成團(tuán)（3分）；大量炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)（4分）。

2.5免疫組織化學(xué)染色法石蠟切片常規(guī)脫蠟后水化，置于修復(fù)盒內(nèi)并用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌5 min×3次，滴加阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫孵育10 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加10%山羊血清封閉，30 min后吸去再加抗GPR40抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃復(fù)溫30 min，PBS洗滌5 min×3次，加HRP標(biāo)記聚合物室溫孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色鏡下觀察顯色反應(yīng)，純水終止顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

2.6Western blot分析各組小鼠肺組織樣本勻漿裂解于含1% PMSF的RIPA緩沖液，BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，樣品蛋白（40 μg）在10% Tris/glycine SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。隨后在室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，與抗體共同于4 ℃孵育過(guò)夜。TBST沖洗后，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）與PVDF膜在室溫孵育2 h，再采用ECL檢測(cè)試劑和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。

2.7RhoA pulldown活化檢測(cè)GTP-RhoA蛋白采用RhoA pulldown活化試劑盒。肺組織碎片化，裂解緩沖液中裂解，離心。每份樣品上清液分別用40μg rhotekin-RBD或PAK-PBD瓊脂糖珠結(jié)合，4 ℃緩慢攪拌孵育1 h。瓊脂糖珠經(jīng)離心、沉降、洗滌3次后重懸，使用抗RhoA抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)沉淀的GTP-RhoA表達(dá)。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算均采用SPSS 18.0軟件。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，然后采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　GPR40在過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織中表達(dá)的變化

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與control組小鼠相比，OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織中GPR40表達(dá)顯著增加（<0.01），見(jiàn)圖2。

Figure 2.Expression of GPR40 protein in the lung tissue of mice with allergic asthma （immunohistochemical staining，scale bar=20 μm）. Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs control group.

2　抑制GPR40對(duì)小鼠AHR的影響

小鼠肺功能儀結(jié)果顯示了3.125～50 mg/L MCh霧化后小鼠aw的變化。隨著吸入MCh濃度的升高，各組小鼠aw增大。與control組小鼠相比，OVA組小鼠從25～50 g/L MCh開(kāi)始，aw顯著升高（<0.05），dyn顯著降低（<0.01）；而10 mg/kg DC260126組aw升高幅度顯著降低（<0.01），dyn顯著升高（<0.01），肺順應(yīng)性顯著改善，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Results of airway resistance （Raw） and dynamic compliance （Cdyn） in the mice of each group. The changes of Raw（A） and Cdyn（B） were determined using a whole-body plethysmography. Mean±SD. n=7. *P<0.05，**P<0.01 vs control group； #P<0.05，##P<0.01 vs OVA group.

3　抑制GPR40對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，OVA組小鼠在小鼠肺部氣道和小血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著（0.01），黏膜及黏膜下層水腫，氣管壁顯著增厚，肺毛細(xì)血管水腫；而control組小鼠肺部氣道的黏膜無(wú)明顯水腫，周圍未見(jiàn)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；10 mg/kg DC260126組小鼠的肺部氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較OVA組顯著減少（0.01），支氣管上皮基本完整，毛細(xì)血管水腫減輕，見(jiàn)圖4。

Figure 4.HE staining results of lung tissues of mice in each group （scale bar=50 μm） and the severity of inflammation graded based on the 5-point scoring system. Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs OVA group.

4　抑制GPR40對(duì)BALF內(nèi)細(xì)胞分類的影響

BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，OVA組細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量和巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著增多（<0.01），而10 mg/kg DC260126組這些指標(biāo)均顯著下降（0.01），趨于正常，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Classification and counting of cells in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） from the mice in each group. The number of total inflammatory cells in BALF （A） were calculated，and a minimum of 200 cells were employed to classify eosinophils （B），lymphocytes （C） and macrophages （D） after the last OVA challenge. Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs OVA group.

5　抑制GPR40對(duì)RhoA/ROCK1信號(hào)通路的影響

Western blot分析顯示，與control組相比，OVA組小鼠肺組織GPR40表達(dá)顯著上升（<0.01），10 mg/kg DC260126組小鼠肺組織內(nèi)由OVA誘導(dǎo)表達(dá)的GPR40蛋白顯著下降（<0.01），見(jiàn)圖6A。此外，OVA組小鼠肺組織內(nèi)RhoA活化（<0.01），然而10 mg/kg DC260126顯著下調(diào)GTP-RhoA的表達(dá)（<0.01），見(jiàn)圖6B。同時(shí)，10 mg/kg DC260126也抑制過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織內(nèi)由OVA誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROCK1表達(dá)（<0.05），見(jiàn)圖6C。

Figure 6.The protein levels of GPR40 （A），GTP-RhoA （B） and ROCK1 （C） in the lung tissues of mice in each group were measured by Western blot. Mean±SD. n=4 to 6. *P<0.05，**P<0.01 vs control group； #P<0.05，##P<0.01 vs OVA group.

討論

本研究通過(guò)建立OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠模型，在此基礎(chǔ)上給予不同濃度的GPR40小分子抑制劑——DC260126，觀察并研究抑制GPR40對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠的炎癥浸潤(rùn)、AHR等的影響，研究結(jié)果顯示抑制GPR40能夠有效降低過(guò)敏性哮喘模型中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及AHR。此外，我們觀察到RhoA/ROCK1信號(hào)通路可能共同參與了哮喘的發(fā)病機(jī)制。據(jù)我們所知，這是首次明確GPR40抑制劑在過(guò)敏性哮喘的作用，研究結(jié)果提示GPR40可能是哮喘治療的分子靶點(diǎn)。

哮喘是一種全球常見(jiàn)的慢性氣道疾病，其病理生理復(fù)雜，具有支氣管收縮、炎癥、AHR等多種致病特點(diǎn)［19］。有研究證明，GPCRs在調(diào)節(jié)氣道平滑肌收縮和氣道炎癥方面發(fā)揮了重要作用［20-21］。激活或失活GPCRs是哮喘的主要治療手段，因此，尋找新型GPCR激動(dòng)劑或拮抗劑成為開(kāi)發(fā)新型、有效的抗哮喘藥物的重要途徑［22］。一般認(rèn)為，氣道平滑肌細(xì)胞是形成氣道高反應(yīng)性的主要細(xì)胞類型［23］，其收縮特性的改變?cè)谙瓪獾栏叻磻?yīng)性的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［24］。近來(lái)，研究人員顯示GPR40在氣道平滑肌細(xì)胞上表達(dá)，在介導(dǎo)氣道平滑肌收縮中發(fā)揮重要作用［11，25］。與上述研究結(jié)果一致，我們證明哮喘小鼠肺內(nèi)GPR40表達(dá)水平明顯升高。

AHR是過(guò)敏性哮喘的臨床癥狀之一，持續(xù)的AHR會(huì)引起肺功能的下降，氣道阻力升高，肺順應(yīng)性下降，影響過(guò)敏性哮喘患者的生活。本實(shí)驗(yàn)顯示，OVA組小鼠對(duì)MCh的反應(yīng)性顯著高于control組，說(shuō)明OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠表現(xiàn)出較強(qiáng)的AHR；而GPR40抑制劑高劑量組小鼠的aw值顯著下降，dyn值顯著升高，提示抑制GPR40能夠有效降低OVA誘導(dǎo)過(guò)敏性小鼠產(chǎn)生的AHR，減輕哮喘癥狀。

過(guò)敏性哮喘病理特征一般表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的Th2免疫反應(yīng)及其導(dǎo)致的嗜酸粒細(xì)胞性氣道炎癥和氣道重塑變窄。本研究通過(guò)肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)，與OVA誘導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘小鼠相比，10 mg/kg DC260126能顯著緩解肺內(nèi)支氣管、血管及其周圍的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。另外。抑制GPR40能夠顯著減輕過(guò)敏性哮喘小鼠BALF中炎癥細(xì)胞蓄積，尤其是嗜酸性粒細(xì)胞。嗜酸性粒細(xì)胞是過(guò)敏性哮喘氣道黏膜最具特征性的炎性細(xì)胞，與哮喘癥狀、氣流阻塞和AHR密切相關(guān)［26］。嗜酸性粒細(xì)胞在肥大細(xì)胞釋放的過(guò)敏性嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子作用下，在氣道及肺組織內(nèi)聚集。嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生和活化受控于Th2細(xì)胞，活化的嗜酸性粒細(xì)胞會(huì)分泌血小板活化因子、白三烯等炎癥介質(zhì)，引起支氣管平滑肌收縮，微血管通透性增加等引起氣道炎癥和高反應(yīng)。有大量研究證實(shí)GPCRs在嗜酸性粒細(xì)胞中的功能和調(diào)控作用［27-28］，減少嗜酸性粒細(xì)胞能抑制或減輕過(guò)敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展［29］，結(jié)合本研究BALF中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)及HE染色結(jié)果，提示抑制GPR40表達(dá)具有減輕過(guò)敏性哮喘炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的作用。

為了探討GPR40調(diào)控AHR和炎癥的分子機(jī)制，我們重點(diǎn)研究了RhoA/ROCK1信號(hào)通路。RhoA及其下游的ROCK最近被認(rèn)為是哮喘的治療靶點(diǎn)［30］。RhoA的激活已被證實(shí)在平滑肌收縮中起重要作用，包括大鼠和小鼠氣道［31］。阻斷RhoA/ROCK1信號(hào)可預(yù)防過(guò)敏性氣道炎癥，也可逆轉(zhuǎn)蟑螂過(guò)敏原引起的氣道重塑［32］。重要的是，RhoA已被報(bào)道定位在眾多GPCRs的下游，并作為近端效應(yīng)分子調(diào)節(jié)多種基本細(xì)胞功能［33］，這促使我們探討GPR40在OVA誘導(dǎo)的哮喘中是否調(diào)節(jié)RhoA活性。本研究結(jié)果表明，過(guò)敏性哮喘小鼠肺組織中GTP-RhoA和ROCK1表達(dá)顯著升高，而DC260126顯著抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠肺組織中GTP-RhoA和ROCK1的表達(dá)。這表明GPR40調(diào)控過(guò)敏性哮喘小鼠RhoA/ROCK1信號(hào)通路。

綜上所述，我們證明抑制GPR40能有效緩解OVA誘導(dǎo)過(guò)敏性小鼠的病理生理，包括肺部炎癥浸潤(rùn)和AHR。此外，抑制GPR40明顯下調(diào)RhoA和ROCK1的活化，從而提示GPR40與過(guò)敏性哮喘小鼠RhoA/ROCK1信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)。本研究為GPR40抑制劑治療哮喘的炎癥、AHR等提供了科學(xué)的藥理實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但GPR40抑制劑用于臨床治療哮喘仍需要進(jìn)一步的研究。

［1］ Saglani S，Lloyd CM. Novel concepts in airway inflammation and remodelling in asthma［J］. Eur Respir J，2015，46（6）：1796-1804.

［2］ Pavord ID，Beasley R，Agusti A，et al. After asthma： redefining airways diseases［J］. Lancet，2018，391（10118）：350-400.

［3］ Schoettler N，Strek ME. Recent advances in severe asthma： from phenotypes to personalized medicine［J］. Chest，2020，157（3）：516-528.

［4］ Zaidan MF，Ameredes BT，Calhoum WJ. Management of acute asthma in adults in 2020［J］. JAMA，2020，323（6）：563-564.

［5］ Weis WI，Kobilka BK. The molecular basis of G protein-coupled receptor activation［J］. Annu Rev Biochem，2018，87：897-919.

［6］ Wendell SG，F(xiàn)an H，Zhang C. G protein-coupled receptors in asthma therapy： pharmacology and drug action［J］. Pharmacol Rev，2020，72（1）：1-49.

［7］ Sharma N，Bhagat S，Chundawat TS. Recent advances in development of GPR40 modulators （FFA1/FFAR1）： an emerging target for type 2 diabetes［J］. Mini Rev Med Chem，2017，17（11）：947-958.

［8］ Mizuta K，Zhang Y，Mizuta F，et al. Novel identification of the free fatty acid receptor FFAR1 that promotes contraction in airway smooth muscle［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2015，309（9）：L970-L982.

［9］ Shapiro H，Shachar，S，Sekler I，et al. Role of GPR40 in fatty acid action on the beta cell line INS-1E［J］. Biochem Biophys Res Commun，2005，335（1）：97-104.

［10］ 張景鴻，李超乾. 支氣管哮喘氣道高反應(yīng)性機(jī)制的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2011，10（3）：304-307.

Zhang JH，Li CQ. Research progress on the mechanism of airway hyperresponsiveness in bronchial asthma［J］. Chin J Respir Crit Care Med，2011，10（3）：304-307.

［11］ Matoba A，Matsuyama N，Shibata S，et al. The free fatty acid receptor 1 promotes airway smooth muscle cell proliferation through MEK/ERK and PI3K/Akt signaling pathways［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2018，314（3）：L333-L348.

［12］ Chiba Y，Matsusue K，Misawa M. RhoA，a possible target for treatment of airway hyperresponsiveness in bronchial asthma［J］. J Pharmacol Sci，2010，114（3）：239-247.

［13］ Biro M，Munoz MA，Weninger W. Targeting Rho-GTPases in immune cell migration and inflammation［J］. Br J Pharmacol，2014，171（24）：5491-5506.

［14］ Xu C，Wu X，Lu M，et al. Protein tyrosine phosphatase 11 acts through RhoA/ROCK to regulate eosinophil accumulation in the allergic airway［J］. FASEB J，2019，33（11）：11706-11720.

［15］ Amison RT，Momi S，Morris A，et al. RhoA signaling through platelet P2Y1receptor controls leukocyte recruitment in allergic mice［J］. J Allergy Clin Immunol，2015，135（2）：528-538.

［16］ Bhattacharya M，Sundaram A，Kudo M，et al. IQGAP1-dependent scaffold suppresses RhoA and inhibits airway smooth muscle contraction［J］. J Clin Invest，2014，124（11）：4895-4898.

［17］ Zeng Z，Lin X，Zheng R，et al. Celastrol alleviates airway hyperresponsiveness and inhibits Th17 responses in obese asthmatic mice［J］. Front Pharmacol，2018，9：49.

［18］ Sun P，Wang T，Zhou Y，et al. DC260126： a small-molecule antagonist of GPR40 that protects against pancreatic β-cells dysfunction in/mice［J］. PLoS One，2013，8（6）：e66744.

［19］ Sharma P，Yi R，Nayak AP，et al. Bitter taste receptor agonists mitigate features of allergic asthma in mice［J］. Sci Rep，2017，7：46166.

［20］ Billington CK，Penn RB. Signaling and regulation of G protein-coupled receptors in airway smooth muscle［J］. Respir Res，2003，4：2.

［21］ Deshpande DA，Penn RB. Targeting G protein-coupled receptor signaling in asthma［J］. Cell Signal，2006，18（12）：2105-2120.

［22］ Madigan LA，Wong GS，Gordon EM，et al. RGS4 overexpression in lung attenuates airway hyperresponsiveness in mice［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2018，58（1）：89-98.

［23］ Janssen LJ. Airway smooth muscle as a target in asthma and the beneficial effects of bronchial thermoplasty［J］. J Allergy （Cairo），2012，2012：593784.

［24］ Black JL，Panettieri RA Jr，Banerjee A，et al. Airway smooth muscle in asthma： just a target for bronchodilation？［J］. Clin Chest Med，2012，33（3）：543-558.

［25］ Mizuta K，Matoba，A，Shibata S，et al. Obesity-induced asthma： Role of free fatty acid receptors［J］. Jpn Dent Sci Rev，2019，55（1）：103-107.

［26］ Brussino L，Heffler E，Bucca C，et al. Eosinophils target therapy for severe asthma： critical points［J］. Biomed Res Int，2018，2018：7582057.

［27］ Ilmarinen P，James A，Moilanen E，et al. Enhanced expression of neuropeptide S （NPS） receptor in eosinophils from severe asthmatics and subjects with total IgE above 100IU/ml［J］. Peptides，2014，51：100-109.

［28］ Tamaki M，Konno Y，Kobayashi Y，et al. Expression and functional roles of G-protein-coupled estrogen receptor （GPER） in human eosinophils［J］. Immunol Lett，2014，160（1）：72-78.

［29］ 張翊玲，曹穎，鄭夢(mèng)凝，等. 刪除嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)支氣管哮喘模型小鼠sPLA2-X的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2020，36（10）：1818-1824.

Zhang YL，Cao Y，Zheng MN，et al. Effects of eosinophils deletion on sPLA2-X in bronchial asthma model mice［J］. Chin J Pathophysiol，2020，36（10）：1818-1824.

［30］ Yu OM，Brown JH. G protein-coupled receptor and RhoA-stimulated transcriptional responses： links to inflammation，differentiation，and cell proliferation［J］. Mol Pharmacol，2015，88（1）：171-180.

［31］ Chiba Y，Uchida T，Sakai H，et al. Acetylcholine-induced translocation of RhoA in freshly isolated single smooth muscle cells of rat bronchi［J］. J Pharmacol Sci，2004，95（4）：479-482.

［32］ Ke X，Do DC，Li C，et al. Ras homolog family member A/Rho-associated protein kinase 1 signaling modulates lineage commitment of mesenchymal stem cells in asthmatic patients through lymphoid enhancer-binding factor 1［J］. J Allergy Clin Immunol，2019，143（4）：1560-1574.e6.

［33］ Zhang Y，Saradna A，Ratan R，et al. RhoA/Rho-kinases in asthma： from pathogenesis to therapeutic targets［J］. Clin Transl Immunol，2020，9（5）：e01134.

Inhibition of GPR40 alleviates allergic asthma in mice through RhoA/ROCK1 signaling pathway

Lin Xi-xi1，Wang Li-ke2，Wan Jin-yi2，Zhang Wei-xi2，Zhao Wei3△

（1，，325027，；2，，325027，；3，325027，）

To investigate the effect of inhibition of G-protein-coupled receptor 40 （GPR40） on the symptoms of asthmatic mice，and to explore the mechanism.Healthy male C57BL/6 mice （=28） were randomly divided into normal control group，model group，low-dose GPR40 inhibitor DC260126 group （3 mg/kg DC260126 group） and high-dose DC260126 group （10 mg/kg DC260126 group）. The allergic asthma mouse model was induced by ovalbumin. The airway hyperresponsiveness was detected by the mouse lung function instrument. The pathological changes of the lung tissues were observed by HE staining. The protein levels of GPR40，GTP-RhoA and Rho-associated kinase 1 （ROCK1） in lung tissues were determined by Western blot.Compared with model group，DC260126 at the dose of 10 mg/kg significantly reduced the airway resistance and the accumulation of inflammatory cells. The inhibition of GPR40 decreased the infiltration of eosinophils and lymphocytes in lung tissues. In addition，both GTP-RhoA and ROCK1 were significantly decreased after the treatment with 10 mg/kg DC260126.Inhibition of GPR40 attenuates the airway inflammation and airway hyperresponsiveness of allergic asthma mice through the Rho/ROCK1 signaling pathway.

Asthma； G-protein-coupled receptor 40； Rho/ROCK1 signaling pathway； Airway hyperresponsiveness

R562.2+5； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.002

1000-4718（2022）02-0202-07

2021-09-23

2021-11-23

［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81803544）

Tel： 0577-88002944； E-mail： wzhao@hotmail.com

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）