魏桂梅， 任錕， 趙璐， 陳芳， 張珂珂， 燕樹勛

薯蕷皂苷通過調控SIRT1-FoxO1-自噬通路減輕糖尿病大鼠胰島素抵抗*

魏桂梅1， 任錕2， 趙璐1， 陳芳1， 張珂珂1， 燕樹勛3△

（1河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院內分泌科，河南 鄭州 450004；2河南省中醫(yī)院康復科，河南 鄭州 450053；3河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院內分泌科二病區(qū)，河南 鄭州 450099）

探究薯蕷皂苷是否通過調控沉默信息調節(jié)因子1（sirtuin 1，SIRT1）-叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）-自噬通路減輕糖尿病大鼠胰島素抵抗。將60只SPF級SD大鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量（5 mg/kg）薯蕷皂苷組、中劑量（10 mg/kg）薯蕷皂苷組、高劑量（20 mg/kg）薯蕷皂苷組和薯蕷皂苷（20 mg/kg）+EX-527（SIRT1抑制劑）組，每組10只。高脂飼料喂養(yǎng)4周后腹腔注射鏈脲佐菌素以構建2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，低、中、高劑量薯蕷皂苷組和薯蕷皂苷+EX-527組大鼠分別灌胃相應劑量藥物，對照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，每天1次，為期4周。全自動生化分析儀檢測血清中空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平，酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測血清空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平，計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）和胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI），行口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT），計算OGTT曲線下區(qū)域面積（area under curve，AUC）；HE染色觀察大鼠胰腺組織損傷情況；使用Western blot檢測胰腺組織中beclin-1、LC3及SIRT1-FoxO1自噬通路相關蛋白的表達。與對照組相比，模型組FBG、AUC、FINS、HOMA-IR、體重、TG、TC和LDL-C水平、胰腺組織損傷程度及FoxO1水平顯著增加，ISI、beclin-1、LC3-II/LC3-I和SIRT1水平顯著降低（<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組FBG、AUC、FINS、HOMA-IR、體重、TG、TC和LDL-C水平、胰腺組織損傷程度及FoxO1水平以薯蕷皂苷劑量依賴性的方式顯著降低，ISI、beclin-1、LC3-II/LC3-I和SIRT1水平以薯蕷皂苷劑量依賴性的方式顯著增加（<0.05）；與高劑量薯蕷皂苷組相比，薯蕷皂苷+EX-527組FBG、AUC、FINS、HOMA-IR、體重、TG、TC和LDL-C水平、胰腺組織損傷程度及FoxO1水平顯著增加，ISI、beclin-1、LC3-II/LC3-I和SIRT1水平顯著降低（<0.05）。薯蕷皂苷可能通過激活SIRT1-FoxO1-自噬通路減輕T2DM大鼠胰島素抵抗。

薯蕷皂苷；2型糖尿病；胰島素抵抗；SIRT1-FoxO1信號通路；自噬

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的決定性致病性因素，當胰腺中的胰島細胞所分泌的胰島素不再能夠有效促使代謝組織攝取葡萄糖時，就會導致IR的發(fā)生，除此之外，葡萄糖代謝的紊亂也會導致肝內糖原積累，從而誘發(fā)多種微血管疾?。?-3］。因此，有效減輕IR對T2DM的治療至關重要。迄今為止已有多種植物化合物被證明具有減輕IR的作用，薯蕷皂苷作為一種植物來源的化合物具有治療肥胖癥的功效，而肥胖是造成IR發(fā)生的主要因素，從而有研究學者猜測，薯蕷皂苷可能成為高脂飲食所致IR的潛在治療藥物［1］。有研究表明，IR與自噬間存在關聯(lián)，基因敲除小鼠表現(xiàn)出全身IR［4-5］。沉默信息調節(jié)因子1（sirtuin 1，SIRT1）可通過促進胰島素受體磷酸化來調節(jié)胰島素通路，而叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）作為T2DM進展中胰島素抵抗的重要下游因素，抑制其表達可提高肝臟的胰島素敏感性，有研究顯示激活SIRT1-FoxO1通路可減輕高脂小鼠肝臟IR［6］。SIRT1-FoxO1通路可通過影響自噬相關基因表達來影響糖尿病的發(fā)生發(fā)展［7］。薯蕷皂苷可通過激活SIRT1-FoxO1通路來抑制多柔比星誘導的小鼠肝損傷［8］。但關于薯蕷皂苷通過調控SIRT1-FoxO1通路減輕糖尿病大鼠IR的研究還未見報道，由于大鼠T2DM與人類T2DM存在相同的病理特征，因此，本項工作通過構建T2DM大鼠模型對其進行探究，以期為薯蕷皂苷在IR中的治療提供參考資料。

材料和方法

1　動物

SPF級雄性8周齡SD大鼠60只購自中山大學東校區(qū)實驗動物中心，生產許可證為SCXK（粵）2021-0029，（280±10） g，適應性飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院7 d［使用許可證：SYXK（豫）2017-0001］，正常12 h明暗交替，實驗前禁食12 h，適應期內采食、飲水自由。

2　主要試劑

總蛋白提取試劑盒購自英文特生物技術（北京）有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司；山羊抗兔IgG H&L（HRP）抗體及兔抗SIRT1和beclin-1抗體購自Abcam；兔抗GAPDH、FoxO1和LC3抗體購自Cell Signaling Technology；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒及高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司。邁瑞Mindray全自動生化分析儀BS-230購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Protein Simple。

3　主要方法

3.1分組與T2DM模型構建將所購買的SD大鼠（60只）按隨機分為：對照（control）組，模型（model）組，低劑量（5 mg/kg）、中劑量（10 mg/kg）和高劑量（20 mg/kg）薯蕷皂苷組，薯蕷皂苷（20 mg/kg）+EX-527（5 mg/kg）組［9］，每組10只。T2DM大鼠模型構建：模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)4周后腹腔注射鏈脲佐菌素（25 g/L，使用檸檬酸緩沖鹽溶液配制為2.5 g/L），對照組大鼠用基礎飼料喂養(yǎng)，檸檬酸鈉緩沖鹽溶液等體積腹腔注射；模型大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥11.1 mmol/L即為造模成功［10］，造模成功后低、中、高劑量薯蕷皂苷組和薯蕷皂苷+EX-527組大鼠分別灌胃相應劑量藥物，對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，為期4周。

3.2大鼠一般指標監(jiān)測于末次灌胃給藥后禁食16 h，抽取大鼠腹主動脈血（4 mL）。使用全自動生化分析儀檢測血清中FBG、TG、TC、LDL-C和HDL-C水平，ELISA法檢測血清空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）水平，計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）及胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）并稱取體重；HOMA-IR=FBG×FINS/22.5； ISI=1/（FBG×FINS）。

3.3口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT）取血結束后對大鼠給予2 g/kg葡萄糖溶液灌胃，檢測0.5、1和2 h血糖水平，計算OGTT曲線下面積（area under curve，AUC）。

3.4HE染色觀察大鼠胰腺組織損傷情況OGTT檢測結束后隨機選取5只大鼠進行頸椎脫臼處死，取其胰腺組織進行多聚甲醛固定（4%、24 h）、脫水后包埋、切片（3 μm），脫蠟、水化后行HE染色，脫水封片后于顯微鏡下觀察。

3.5Western blot檢測胰腺組織中beclin-1、LC3-II/LC3-I及SIRT1-FoxO1-自噬通路相關蛋白的表達 另取5只大鼠胰腺組織，于RIPA裂解液中進行裂解，提取組織總蛋白后進行BCA蛋白濃度檢測，將上樣緩沖液與蛋白混勻后水浴加熱煮沸、變性（10 min）、SDS-PAGE分離蛋白后低溫轉膜、5%脫脂奶粉溶液封閉1.5 h，添加兔抗beclin-1、LC3-II/LC3-I、SIRT1、FoxO1和GAPDH抗體（1∶1 000），4 ℃冰箱中孵育過夜，TBST緩沖液清洗，加入HRP標記的IgG Ⅱ抗（1∶10 000）孵育2 h，TBST緩沖液清洗后添加ECL化學發(fā)光試劑進行顯色，蛋白凝膠成像儀掃描觀察，Quantity One 4.6軟件分析圖像，ImageJ軟件對蛋白條帶進行分析，計算beclin-1、LC3-II/LC3-I、SIRT1、FoxO1和p-FoxO1蛋白的含量。

4　統(tǒng)計學處理

數(shù)據使用SPSS 23.0進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用平均數(shù)±標準差（mean±SD）進行描述，單因素方差分析進行多組間比較，進一步兩兩比較使用SNK-檢驗，以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　薯蕷皂苷對大鼠FBG、AUC、FINS、HOMA-IR和ISI的影響

與對照組相比，模型組大鼠FBG、AUC、FINS和HOMA-IR水平增加，ISI降低（<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量薯蕷皂苷組FBG、AUC、FINS和HOMA-IR水平呈劑量依賴性顯著降低，ISI增加（<0.05）；與高劑量薯蕷皂苷組相比，薯蕷皂苷+EX-527組FBG、AUC、FINS和HOMA-IR水平增加，ISI降低（<0.05），見圖1。

Figure 1.Effects of dioscin on FBG （A），AUC （B），F(xiàn)INS （C），HOMA-IR （D） and ISI （E） in rats. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs low-dioscin group； ▲P<0.05 vs medium-dioscin group； @P<0.05 vs high-dioscin group.

2　薯蕷皂苷對大鼠體重及血脂水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠體重、TG、TC和LDL-C水平增加（<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量薯蕷皂苷組體重、TG、TC和LDL-C水平劑量依賴性顯著降低（<0.05）；與高劑量薯蕷皂苷組相比，薯蕷皂苷+EX-527組體重、TG、TC和LDL-C水平增加（<0.05）；HDL-C在各組間均無顯著性差異（>0.05），見圖2。

Figure 2.Effects of dioscin on body weight and blood lipid levels of rats. Mean±SD. n=10. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs low-dioscin group； ▲P<0.05 vs medium-dioscin group； @P<0.05 vs high-dioscin group.

3　薯蕷皂苷對大鼠胰腺組織損傷的影響

對照組胰島邊界清晰、細胞結構正常；模型組胰島萎縮并且數(shù)量減少、邊界模糊不清、細胞固縮明顯可見；與模型組相比，低、中、高劑量薯蕷皂苷組胰島數(shù)量增加，細胞結構逐漸正常；與高劑量薯蕷皂苷組相比，薯蕷皂苷+EX-527組薯蕷皂苷減輕胰腺組織損傷的作用減弱，見圖3。

Figure 3.Effect of dioscin on pancreatic tissue injury in rats （HE staining，scale bar=25 μm）.

4　薯蕷皂苷對大鼠胰腺組織beclin-1、LC3-II/LC3-I、SIRT1和FoxO1蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠胰腺組織beclin-1、LC3-II/LC3-I和SIRT1水平降低，F(xiàn)oxO1水平增加（<0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量薯蕷皂苷組血清beclin-1、LC3-II/LC3-I和SIRT1水平劑量依賴性顯著增加，F(xiàn)oxO1水平降低（<0.05）；與高劑量薯蕷皂苷組相比，薯蕷皂苷+EX-527組beclin-1、LC3-II/LC3-II和SIRT1水平降低，F(xiàn)oxO1水平增加（<0.05）。見圖4。

Figure 4.Effect of dioscin on the expression of beclin-1，LC3-II/LC3-I and SIRT1-FoxO1-autophagy pathway-related proteins in rat pancrea tissues. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs low-dioscin group； ▲P<0.05 vs medium-dioscin group； @P<0.05 vs high-dioscin group.

討論

T2DM是一種影響人類健康的全球性問題，近年來，其發(fā)病率在不斷增加，因此急需深入探究病理機制，而有研究顯示，T2DM的主要致病因素與IR相關［11-12］。胰島素是機體內葡萄糖代謝的有效調節(jié)劑，可有效維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，而IR則意味著組織對胰島素刺激所產生的應答能力減弱，這將增加T2DM患者肥胖、血脂異常、高血壓等不良事件發(fā)生的風險［13］。因此，有效抑制IR對T2DM的治療極為關鍵。

薯蕷皂苷是一種從藥用植物或蔬菜中分離得到的天然甾體皂苷，對糖尿病、肥胖等代謝性疾病具有緩解作用［14-15］。薯蕷皂苷可通過降血糖、血脂、增加肝糖原含量和減少脂質積累來緩解T2DM患者糖脂代謝失調情況［16］。薯蕷皂苷通過激活胰島素受體底物1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（insulin receptor substrate-1/phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，IRS-1/PI3K/Akt）信號通路來減弱高脂飲食大鼠脂肪組織的IR［1］。薯蕷皂苷通過促進miR-125a-5p表達來減輕IR，減輕T2DM小鼠糖脂代謝紊亂，發(fā)揮抗T2DM活性［16］。薯蕷皂苷可有效降低db/db小鼠IR及肝組織脂肪變性，減輕糖脂質代謝的紊亂。上述研究表明薯蕷皂苷具有抑制IR，調節(jié)糖脂質代謝的功效。IR的發(fā)展與脂代謝紊亂密切相關，而脂代謝紊亂以TG和TC增加為主要特征［18］。胰腺的內分泌腺由胰島組成，可分泌胰島素及胰高血糖素調節(jié)血糖平衡，機體IR發(fā)生時，胰島細胞受損，進而導致胰腺組織損傷，有研究發(fā)現(xiàn)，IR狀態(tài)下，胰腺組織代謝紊亂［18］。本實驗顯示，薯蕷皂苷可有效降低T2DM大鼠血脂、血糖及IR，增加大鼠胰島素敏感性，減輕胰腺組織損傷，與前人研究結果相似［16］。

自噬作為細胞內一個高度保守的生物學過程，在維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，研究顯示該過程與IR的發(fā)生密切相關，當自噬受到抑制時，會引發(fā)線粒體等損傷細胞器的大量積聚，從而產生活性氧等代謝產物的積累，進而影響胰島素信號的傳導，從而引發(fā)IR［19］。薯蕷皂苷通過促進SIRT3表達和自噬功能來預防Aβ1-42寡聚體所誘導的海馬神經細胞的神經毒性發(fā)生［20］。薯蕷皂苷可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）/雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）通路促進自噬，調節(jié)脂質代謝平衡，預防絕經后小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生［21］。上述研究表明，薯蕷皂苷能通過多種途徑促進自噬水平。本研究顯示，薯蕷皂苷可促進T2DM大鼠胰腺組織自噬相關基因beclin-1和LC3-II/LC3-I的表達，該結果表明薯蕷皂苷促進T2DM大鼠自噬的發(fā)生，其對IR的減輕可能與其促進自噬有關。

SIRT1作為一種NAD依賴性蛋白脫乙酰酶，參與多種代謝疾病的改善，其可增加肝臟中的胰島素敏感性，并且與不同病理狀態(tài)下的IR緊密相關［6］。SIRT1可通過促進FOXO1的去乙?；瘉碚{節(jié)FOXO1的活性，從而調控自噬的發(fā)生［7］。FoxO1已被證明是參與T2DM進程中IR的一個重要下游因素。在IR發(fā)生時，抑制FoxO1表達可提高肝臟胰島素敏感性［22］。云脾合絡湯可通過激活糖尿病肥胖大鼠骨骼肌SIRT1-FoxO1-自噬通路來改善脂質代謝，增強自噬水平，以此抑制IR［22］。薯蕷皂苷可通過促進SIRT1/AMPK信號通路來抑制FoxO1表達水平，從而減弱高脂飲食誘導的小鼠肝臟脂質的積累［23］。但目前關于薯蕷皂苷調控SIRT1-FoxO1-自噬通路減輕糖尿病大鼠IR的研究還未見報道。而本研究顯示，薯蕷皂苷可顯著增加SIRT1水平，降低T2DM大鼠胰腺組織中FoxO1水平，除此之外，SIRT1抑制劑EX-527可逆轉薯蕷皂苷對T2DM大鼠IR的減輕作用。該結果表明薯蕷皂苷對T2DM大鼠IR的減輕作用可能與其激活SIRT1-FoxO1-自噬通路，從而增強自噬有關。綜上所述，薯蕷皂苷可能通過激活SIRT1-FoxO1-自噬通路來達到減輕T2DM大鼠胰島素抵抗的作用。

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Dioscin attenuates insulin resistance in diabetic rats by regulating SIRT1-FoxO1-autophagy signaling pathway

WEI Gui-mei1，REN Kun2，ZHAO Lu1，CHEN Fang1，ZHANG Ke-ke1，YAN Shu-xun3△

（1，，450004，；2，，450053，；3，，450099，）

To explore whether dioscin regulates sirtuin 1 （SIRT1）-forkhead box protein O1 （FoxO1）-autophagy signaling pathway to attenuate insulin resistance in diabetic rats.Sixty SPF SD rats were randomly divided into control group，model group，low-dose （5 mg/kg） dioscin group，medium-dose （10 mg/kg） dioscin group，high-dose （20 mg/kg） dioscin group and dioscin （20 mg/kg）+EX-527 （SIRT1 inhibitor） group，with 10 mice in each group. Streptozotocin was injected intraperitoneally after feeding with high-fat diet for 4 weeks to establish a rat model of type 2 diabetes mellitus （T2DM）. The rats in low-，medium- and high-dose dioscin groups and dioscin+EX-527 group were given the corresponding doses of drugs by gavage，while those in control group and model group were given the same volume of normal saline by gavage，once daily for 4 weeks. The automatic biochemical analyzer was used to detect fasting blood glucose （FBG），high-density lipoprotein cholesterol （HDL-C），low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C），triglyceride （TG） and total cholesterol （TC） levels. ELISA was used to detect the serum fasting insulin （FINS） level and calculate homeostasis model assessment-insulin resistance （HOMA-IR） and insulin sensitivity index （ISI）. Oral glucose tolerance test （OGTT） was performed to calculate the area under curve （AUC） of the OGTT. HE staining was used to observe the damage of rat pancreatic tissues. Western blot was used to detect the expression of beclin-1，LC3 and SIRT1-FoxO1-autophagy pathway related-proteins in pancreatic tissues.Compared with control group，the FBG，AUC，F(xiàn)INS，HOMA-IR，body weight，TG，TC and LDL-C levels，the pancreatic tissue damage，and the FoxO1 level increased significantly，while the ISI，beclin-1，LC3-II/LC3-I and SIRT1 levels reduced significantly in model group （<0.05）. Compared with model group，the FBG，AUC，F(xiàn)INS，HOMA-IR，body weight，TG，TC and LDL-C levels，the pancreatic tissue damage，and the FoxO1 level reduced significantly，while the ISI，beclin-1，LC3II/LC3-I and SIRT1 levels increased significantly in low-，medium- and high-dose dioscin groups in a dose-dependent manner （<0.05）. Compared with high-dose dioscin group，the FBG，AUC，F(xiàn)INS，HOMA-IR，body weight，TG，TC and LDL-C levels，the pancreatic tissue damage，and the FoxO1 level increased significantly，while the ISI，beclin-1，LC3-II/LC3-I and SIRT1 levels reduced significantly in dioscin+EX-527 group （<0.05）.Dioscin may attenuate the insulin resistance of T2DM rats by activating the SIRT1-FoxO1-autophagy signaling pathway.

Dioscin； Type 2 diabetes mellitus； Insulin resistance； SIRT1-FoxO1 signaling pathway； Autophagy

R581.7；R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.014

1000-4718（2022）02-0303-08

2021-09-14

2021-11-30

［基金項目］河南省中醫(yī)藥科學研究專項課題（No. 20-21ZY2227）；河南省中醫(yī)藥傳承與創(chuàng)新人才工程（仲景工程）中醫(yī)藥學科拔尖人才項目

Tel： 13383861812； E-mail： ysx982001@163.com

（責任編輯：林白霜，余小慧）