蘭金劍， 高瑞蘭， 趙燕娜， 馬閃閃， 王博林， 沈鳳麟， 余瀟苓

20（S）-人參皂苷Rg3抑制人急性單核細胞白血病THP-1細胞遷移和侵襲*

蘭金劍， 高瑞蘭， 趙燕娜， 馬閃閃， 王博林， 沈鳳麟， 余瀟苓△

（浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

觀察低極性20（S）-人參皂苷Rg3（S-Rg3）體外抑制人急性單核細胞白血病THP-1細胞遷移和侵襲的作用。將不同濃度（0、20、40和80 mg/L）的S-Rg3加入THP-1細胞培養(yǎng)體系，Transwell小室檢測S-Rg3抑制細胞遷移的作用。采用免疫細胞化學、免疫熒光、Western blot和RT-qPCR等多種方法，檢測S-Rg3對THP1細胞黏附、遷移和侵襲相關蛋白表達的影響及其相關機制。S-Rg3能有效地抑制THP-1細胞遷移，下調(diào)黏附相關蛋白N-cadherin，遷移相關蛋白C-X-C趨化因子受體4（CXCR4）和基質細胞衍生因子1（SDF-1），以及侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶2（MMP2）的表達，但上調(diào)抑制遷移侵襲相關蛋白E-cadherin金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP1）和TIMP3表達，同時下調(diào)CXCR4 mRNA表達，上調(diào)E-cadherin和TIMP1 mRNA表達，呈劑量依賴性。此外，S-Rg3降低PI3K/AKT信號通路相關蛋白激酶的磷酸化水平。S-Rg3能有效抑制人急性單核細胞白血病THP-1細胞的遷移和侵襲，其機制可能與降低細胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路相關蛋白激酶的磷酸化水平有關。

20（S）-人參皂苷Rg3；THP-1細胞；細胞遷移；細胞侵襲；PI3K/AKT信號通路

白血病是一類造血組織的惡性克隆性疾病，急性單核細胞白血病髓外侵襲的發(fā)生率約20%～40%，可出現(xiàn)在腦組織、肝、脾、淋巴結、皮膚和齒齦等，是最嚴重的并發(fā)癥和主要死亡原因之一［1］，目前尚無有效的治療手段，因此很有必要尋找安全有效抗髓外侵襲的中藥及其有效部位和成分。研究顯示，人參皂苷Rg3可抑制B16黑色素瘤肺轉移，降低B16細胞侵襲力，并明顯延長荷瘤小鼠的生存期［2］。文獻報道中成藥參一膠囊［含20（R）-人參皂苷Rg3］的研究較多，該藥能有效抑制膠質瘤U87細胞的黏附和侵襲能力［3］。然而，有關20（S）-人參皂苷Rg3（S-Rg3）的報道很少，S-Rg3抑制單核細胞白血病細胞遷移和侵襲的作用及其可能的機制未見報道。本項工作以人急性單核細胞白血病THP-1細胞為靶細胞，觀察S-Rg3抑制單核細胞白血病細胞遷移和侵襲的作用。

材料和方法

1　實驗細胞及藥物

THP-1細胞由浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院血液病研究所提供。S-Rg3購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，經(jīng)核磁共振譜、質譜、紅外光譜和紫外吸收光譜鑒定其結構，純度>98%，分子式為C42H72O13，分子量為785.02。

2　實驗方法

2.1細胞培養(yǎng)THP-1細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

2.2Transwell小室檢測細胞遷移能力收集THP-1細胞并調(diào)整細胞懸液濃度至1×108/L，分別加入0、10、20、40和80 mg/L的S-Rg3，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2 d。用無血清的RPMI-1640過夜饑餓24 h，調(diào)整各組細胞濃度為5×105/L，取200 μL細胞懸液接種于小室，24孔板下室中加入600 μL含15%新生牛血清的IMDM，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，將小室置于800 μL 4%多聚甲醛的孔中室溫固定20 min，隨后加入結晶紫染液，染色后顯微鏡下計數(shù)5個隨機視野的細胞數(shù)量，取其平均值。

2.3免疫細胞化學法用0、20、40和80 mg/L的S-Rg3處理THP-1細胞2 d，收集細胞，細胞懸液經(jīng)離心涂片機制成細胞涂片，4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100破膜。加Ⅰ抗，置于4 ℃孵育過夜，加Ⅱ抗工作液，37 ℃孵育30 min，DAB顯色10 min。用蘇木精復染，中性樹脂封片。鏡下觀察棕褐色陽性反應的細胞，陽性程度判斷標準采用ImageJ軟件分析。

2.4免疫熒光法0、20、40和80mg/L的S-Rg3處理THP-1細胞2 d，收集細胞，細胞懸液經(jīng)離心涂片機制片，4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100破膜。加Ⅰ抗，置于4 ℃孵育過夜，加熒光Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h。用含DAPI染料封片劑封片，用熒光顯微鏡（×630）觀察細胞。陽性程度判斷標準采用ImageJ軟件分析。

2.5Western blot法0、20、40和80 mg/L的S-Rg3處理THP-1細胞2 d，收集細胞，加入裂解液提取細胞總蛋白。每孔加樣40 μg總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE分離，將蛋白條帶轉移至NC膜上，室溫下用5% BSA封閉1 h，分別加p-PI3K、p-AKT、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和C-X-C趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）等Ⅰ抗（Cell Signaling Technology），4 ℃孵育過夜，加Ⅱ抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影。采用使用ImageJ軟件分析特異性條帶的灰度值。

2.6RT-qPCR法0、20、40和80 mg/L的S-Rg3處理THP-1細胞2 d，收集細胞，Trizol試劑盒提取細胞總RNA，經(jīng)逆轉錄為cDNA，分別采用特異性引物，進行實時熒光定量PCR。內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5′-CATCAAGGAGAAACTGTGT-3′，下游引物序列為5′-AGGCAACTCGTAACTCTT-3′；TIMP1的上游引物序列為5′-CTTCTGCAATTCCGACCTCGT-3′，下游引物序列為5′-ACGCTGGTATAAGGTGGTCTG-3′；E-cadherin的上游引物序列為5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游引物序列為5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；CXCR4的上游引物序列為5′-ACTACACCGAGGAAATGGGCT-3′，下游引物序列為5′-CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA-3′。PCR條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，39個循環(huán)。

3　統(tǒng)計學處理

用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　S-Rg3抑制THP-1細胞遷移

Transwell實驗結果顯示，S-Rg3處理THP-1細胞2 d后，小劑量10 mg/L組遷移細胞數(shù)與對照組相比無顯著差異，而20、40和80 mg/L組遷移細胞數(shù)顯著低于對照組，抑制率約為10.5%～43.4%，差異有統(tǒng)計學意義（<0.01），見圖1。

Figure 1.The inhibitory effect of S-Rg3 on the migration of THP-1 cells detected by Transwell migration assay. A： control （0 mg/L S-Rg3） group； B： 10 mg/L S-Rg3 group； C： 20 mg/L S-Rg3 group； D： 40 mg/L S-Rg3 group； E： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs A.

2　S-Rg3調(diào)控黏附相關蛋白的表達

經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，免疫熒光染色結果顯示THP-1細胞表達E-cadherin蛋白的熒光強度顯著高于對照組（<0.01），見圖2；免疫細胞化學染色結果顯示，S-Rg3處理細胞后，N-cadherin蛋白的陽性反應顯著低于對照組（<0.01），見圖3。

Figure 2.Effect of S-Rg3 on the protein expression of CXCR4 and E-cadherin in THP-1 cells detected by immunofluorescence （scale bar=50 μm）. A1 to A6： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B6： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C6： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D6： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Figure 3.Effect of S-Rg3 on the protein levels of CXCR4，N-cadherin，p-AKT and SDF-1 in THP-1 cells detected by immunocytochemistry （scale bar=50 μm）. A1 to A4： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B4： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C4： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D4： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

3　S-Rg3下調(diào)遷移相關蛋白的表達

經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，免疫熒光染色結果顯示THP-1細胞表達CXCR4蛋白的熒光強度顯著低于對照組（<0.01），見圖2；免疫細胞化學染色結果顯示，THP-1細胞表達SDF-1蛋白的陽性反應顯著低于對照組（<0.01），見圖3。

Western blot結果與免疫細胞化學染色結果一致，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，CXCR4蛋白表達顯著低于對照組（<0.01），見圖4。

Figure 4.Effect of S-Rg3 on the protein levels of MMP2，CXCR4，p-PI3K and p-AKT in THP-1 cells detected by Western blot.A： control （0 mg/L S-Rg3） group； B： 20 mg/L S-Rg3 group； C： 40 mg/L S-Rg3 group； D： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs A.

4　S-Rg3調(diào)控侵襲相關蛋白的表達

經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，免疫熒光染色結果顯示THP-1細胞表達TIMP1和TIPM3蛋白的熒光強度顯著高于對照組（<0.01），見圖5；而表達MMP2蛋白的熒光強度則顯著低于對照組（<0.01），見圖6。免疫細胞化學染色結果顯示，S-Rg3處理細胞后，TIMP1和TIPM3蛋白表達的陽性程度顯著高于對照組（<0.01），見圖7。

Figure 5.Effect of S-Rg3 on the protein expression of TIMP1 and TIMP3 in THP-1 cells detected by immunofluorescence （scale bar=50 μm）. A1 to A6： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B6： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C6： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D6： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Figure 6.Effect of S-Rg3 on the protein expression of MMP2 in THP-1 cells detected by immunofluorescence （scale bar=50 μm）. A1 to A3： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B3： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C3： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D3： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Figure 7.Effect of S-Rg3 on the protein expression of TIMP1 and TIMP3 in THP-1 cells detected by immunocytochemical staining （scale bar=50 μm）. A1 and A2： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 and B2： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 and C2： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 and D2： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Western blot結果與免疫細胞化學染色結果一致，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，MMP2蛋白表達顯著低于對照組（<0.01），見圖4。

5　S-Rg3降低PI3K和AKT的磷酸化水平

免疫細胞化學染色結果顯示，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，THP-1細胞中p-AKT蛋白的陽性反應顯著低于對照組（<0.01），見圖3。

Western blot結果顯示，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，THP-1細胞中p-AKT和p-PI3K蛋白水平顯著低于對照組（<0.01），見圖4。

6S-Rg3調(diào)控遷移和侵襲相關mRNA的表達

RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，THP-1細胞CXCR4的mRNA表達水平顯著降低（<0.01），而TIMP1和E-cadherin的mRNA表達水平顯著升高（<0.01），見圖8。

Figure 8.Effect of S-Rg3 on the mRNA expression of CXCR4 （A），E-cadherin （B） and TIMP1 （C） in THP-1 cells detected by RT-PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

討論

低極性人參皂苷S-Rg3是從中藥人參中分離出多種人參皂苷單體成分之一。低極性人參皂苷是指含有2個以上糖的原生苷，經(jīng)水解失去部分糖而得到的苷，在人參屬植物中含量低，文獻報道此成分具有抗腫瘤的活性。在腸癌、胃癌、肺癌及乳腺癌等多種腫瘤研究中，人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制遷移和侵襲等抗腫瘤作用［4-5］。人參皂苷Rg3可以通過調(diào)控caspase-8及PARP相關蛋白的表達而激活及誘導凋亡過程，并通過下調(diào)p-AKT蛋白水平而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖及誘導凋亡的作用［6］。但S-Rg3抗單核細胞白血病細胞黏附、遷移和侵襲的作用尚未見報道。本研究結果提示S-Rg3具有抑制THP-1單核細胞白血病細胞遷移及侵襲的作用。

急性單核細胞白血病常發(fā)生髓外侵襲，受細胞因子嚴格調(diào)控，包括白血病細胞的趨化、黏附、遷移和降解基質等多個環(huán)節(jié)，與SDF-1/CXCR4、基質金屬蛋白酶（MMPs）、黏附分子（E-cadherin/N-cadherin）等有關。SDF-1/CXCR4參與調(diào)控白血病細胞的趨化、遷移及侵襲等環(huán)節(jié)［7］，MMPs與白血病細胞的降解基質密切相關［8］，黏附分子參與白血病細胞的黏附、遷移等多個生物活性［9］。有文獻報道白血病細胞中E-cadherin表達喪失，引起細胞黏附能力降低，增殖能力增強［10］；急性白血病患者腦脊液E-cadherin的表達與白血病腦侵襲的發(fā)生密切相關［11］。研究表明，N-cadherin可以促進體內(nèi)白血病細胞的骨髓歸巢、植入和自我更新［12］。本實驗結果顯示S-Rg3作用于THP-1細胞后，可上調(diào)E-cadherin蛋白，但下調(diào)N-cadherin蛋白的表達，提示S-Rg3具有抑制THP-1細胞的黏附和遷移的作用。

SDF-1為趨化因子家族成員，已被證實參與造血干細胞的增殖及歸巢，通過與CXCR4結合，參與許多惡性腫瘤細胞的存活，局部侵襲及轉移，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［13-14］。有研究顯示，降低白血病細胞表面CXCR4的表達水平，可以減弱白血病細胞的遷移能力［15］。本實驗結果顯示S-Rg3作用于THP-1細胞后，可下調(diào)SDF-1和CXCR4其蛋白表達，提示S-Rg3具有抑制THP-1細胞的遷移和侵襲作用。

MMPs為一種鋅依賴的內(nèi)蛋白酶，屬于細胞外基質降解酶家族，可以降解細胞外基質的胞外水解酶，其中起主要作用的是MMP2和MMP9。TIMPs是MMPs的主要生理性抑制因子，其功能涉及抑制MMPs家族成員的活性［16］。已有研究表明，白血病細胞生成的MMP2，為其髓外侵襲發(fā)揮作用［17］。本實驗結果顯示S-Rg3作用于THP-1細胞后，可上調(diào)TIMP1和TIMP3的mRNA及蛋白表達水平，并抑制MMP2蛋白的表達，提示S-Rg3可通過調(diào)控TIMP1、TIMP3和MMP2蛋白而抑制THP-1細胞的侵襲。

在腫瘤組織中PI3K和AKT是調(diào)控細胞生長、分化、侵襲和遷移的重要信號轉導通路，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［18-19］。另有報道PI3K和AKT與白血病細胞的侵襲和遷移能力相關［20］。AKT是PI3K下游最重要的靶蛋白，PI3K發(fā)生磷酸化（p-PI3K）可促進AKT活化，活化的AKT可在細胞漿中發(fā)生磷酸化反應而傳遞生物學信號，從而參與細胞增殖、周期、侵襲等生理過程［21］。鑒于磷酸化是蛋白激酶發(fā)揮其功能的活性狀態(tài)，本研究顯示S-Rg3通過下調(diào)PI3K和AKT的磷酸化水平而抑制THP-1細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，我們的研究表明人參皂苷S-Rg3具有抑制人急性單核細胞白血病THP-1細胞黏附、遷移和侵襲的作用，其機制與下調(diào)PI3K/AKT信號通路相關PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平有關。但S-Rg3是否通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路而發(fā)揮抑制THP-1細胞黏附、遷移和侵襲的作用，尚待深入研究。

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Inhibitory effect of 20(S)-ginsenoside Rg3on migration and invasion of human acute monocytic leukemia THP-1 cells

LAN Jin-jian，GAO Rui-lan，ZHAO Yan-na，MA Shan-shan，WANG Bo-lin，SHEN Feng-lin，YU Xiao-ling△

（，310006，）

To observe the effect of low-polarity 20（S）-ginsenoside Rg3（S-Rg3） on the migration and invasion of human acute monocytic leukemia THP-1 cells.The THP-1 cells were treated with various concentrations （0，20，40 and 80 mg/L） of S-Rg3. The cell migration was detected by Transwell assay. Immunocytochemistry，immunofluorescence，Western blot and RT-qPCR were used to detect the expression of various proteins related to adhesion，migration，invasion and the related mechanisms.Treatment with S-Rg3inhibited the migration of THP-1 cells，and down-regulated the expression of adhesion-related protein N-cadherin，migration-related proteins C-X-C chemokine receptor 4 （CXCR4） and stromal cell-derived factor-1 （SDF-1），and invasion-related protein matrix metalloproteinase 2 （MMP2），but up-regulated the expression of E-cadherin，tissue inhibitor of metalloproteinase 1 （TIMP1） and TIMP3. It also decreased CXCR4 mRNA expression，and stimulated E-cadherin and TIMP1 mRNA expression in a dose-dependent manner. In addition，S-Rg3inhibited PI3K/AKT signaling pathway.Treatment with S-Rg3effectively inhibits the migration and invasion of THP-1 cells，which may be related to inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

20（S）-Ginsenoside Rg3； THP-1 cells； Cell migration； Cell invasion； PI3K/AKT signaling pathway

R730.23； R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.012

1000-4718（2022）02-0284-08

2021-11-25

2022-02-05

［基金項目］浙江省自然科學基金資助項目（No. LQ19H290002； No. LY20H290004）；國家自然科學基金資助項目（No. 81774068）

Tel： 0571-87071625； E-mail： usually07@126.com

（責任編輯：盧萍，羅森）