康東坤， 高外毛▲， 張紅珍， 柴智， 樊慧杰， 肖保國， 馬存根，2△， 劉建春△

黃芪總皂苷對脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞的抗炎機制*

康東坤1， 高外毛1▲， 張紅珍1， 柴智1， 樊慧杰1， 肖保國3， 馬存根1，2△， 劉建春1△

（1山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室，山西 晉中 030619；2山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，中樞神經(jīng)炎癥變性疾病新藥創(chuàng)制省市共建山西省重點實驗室培育基地，山西 大同 037009；3復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病研究所，上海 200025）

探討黃芪總皂苷（TAS）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞炎癥損傷的抗炎作用機制。用CCK-8法篩選出對細胞活力無抑制的藥物濃度；用濃度為1 mg/L的LPS刺激BV2細胞24 h，建立細胞炎癥模型；實驗分為正常組、LPS組、高劑量（75 mg/L）TAS組和低劑量（50 mg/L）TAS組；應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測用藥后細胞膜表面CD16/32表達情況；采用免疫熒光染色檢測細胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg-1）的平均熒光強度；Western blot法檢測腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、Toll樣受體4（（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）、核因子κB（NF-κB） p65和磷酸化NF-κB（p-NF-κB） p65蛋白水平。200 mg/L的TAS對BV2細胞活力有顯著抑制作用（<0.05）；高劑量TAS能顯著降低細胞因LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)；高、低劑量TAS均可顯著減少CD16/32陽性細胞的數(shù)量（<0.05）；免疫熒光顯示，低劑量TAS能顯著減少細胞iNOS表達，顯著增加Arg-1表達（<0.05）；與LPS組相比較，高、低劑量TAS均能顯著降低TNF-α、IL-1β、TLR4、MyD88、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白水平（<0.05）。高、低劑量TAS能抑制BV2細胞向M1型極化，并通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，減少炎癥因子的釋放。

黃芪總皂苷；小膠質(zhì)細胞；脂多糖；炎癥；TLR4/MyD88/NF-κB信號通路

黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Bge. var.（Bge.） Hsiao］的干燥根。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為，黃芪具有補氣固表、托毒排膿的功效［1］。黃芪中有40余種三萜皂苷類化合物，其中黃芪皂苷（Ⅰ～Ⅶ）、異黃芪皂苷（Ⅰ、Ⅱ）、乙酰基黃芪皂苷（cyclocephaloside Ⅱ）和大豆皂苷（trojanoside A、H）這四大類化合物一般統(tǒng)稱為黃芪皂苷或黃芪總皂苷（totalsaponins，TAS）［2-3］。

現(xiàn)代藥理研究表明，TAS具有抗炎、預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的功效［4］。近年來不斷有研究證實，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）受到破壞時，血腦屏障受損，內(nèi)皮功能減退，閉鎖小帶蛋白1表達降低［5］。當血腦屏障通透性增加時，TAS藥物濃度水平在腦內(nèi)升高，并顯著改善實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障功能［6-7］。

BV2細胞是永生化的小鼠小膠質(zhì)細胞，保留神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞多種生物特征，被廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)研究［8］。小膠質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的一種，相當于腦和脊髓中的巨噬細胞，是CNS中的第一道免疫防線，存在其胞膜表面的Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是連接固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵［9］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有11種TLRs（1～11），其中TLR4能夠識別革蘭氏陰性菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［10］。小膠質(zhì)細胞與外周巨噬細胞一樣，在不同類型的細胞因子或LPS的刺激下，可極化為促炎的M1型或抑炎的M2型［11］。在極化成M1型的過程中，LPS通過與小膠質(zhì)細胞表面的TLR4結(jié)合，激活髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴型通路，引起核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化，產(chǎn)生促炎因子，如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），加重神經(jīng)炎癥［12］。

研究表明，抑制小膠質(zhì)細胞向M1型極化，減少其釋放致炎因子，能夠降低炎癥對血腦屏障的損傷，緩解炎癥對CNS內(nèi)環(huán)境的破壞［13］。本實驗采用LPS誘導(dǎo)BV2細胞建立體外細胞炎癥模型［14］，在細胞層面觀察TAS的抗炎作用及其機制。

材料和方法

1　細胞

BV2細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫，用含有10%胎牛血清的DMEM（高糖）培養(yǎng)液，并放置于37 ℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)，以皿中培養(yǎng)液體積的1/4進行每天換液，2～3 d傳代1次［15］。

2　藥物與試劑

TAS由山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院彭曉夏老師饋贈；LPS（L8880）和DAPI染液購自北京索萊寶公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自MCE；CD16/CD32-APC流式抗體、Alexa Fluor 488標記的驢抗鼠IgG（H+L）和Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔IgG（H+L）購自Invitrogen；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠和驢抗兔Ⅱ抗購自愛必信；DMEM（高糖）液體培養(yǎng)基和胎牛血清購自HyClone；鼠抗TLR4（sc-20172）和TNF-α（sc-52746）單克隆抗體購自Santa Cruz；抗NF-κB p65（D14E12）、p-NF-κB p65 Ser536（93H1）、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1；D4E3M）和β-肌動蛋白（β-actin；13E5）抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗MyD88（GTX112987）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS； GTX130246）多克隆抗體購自GeneTex；兔抗離子鈣結(jié)合接頭分子1（ionized calcium-binding adapter molecule-1，Iba-1）單克隆抗體（ab178847）購自Abcam；兔抗IL-1β多克隆抗體購自上海生工有限公司；eECL發(fā)光液、抗淬滅熒光封片液、RIPA細胞裂解液和SDS-PAGE protein loading buffer（5×）購自武漢博士德公司；直徑16 mm細胞爬片購于NEST；PVDF膜（0.45 μm）購于Millipore；Plus Prestained Protein Ladder購于Thermo Fisher Scientific。

3　實驗儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱和低溫冷凍高速離心機（Thermo Fisher）；多功能全波長酶標儀（Molecular Devices）；流式細胞儀（BD）；正置熒光顯微鏡和倒置明場顯微鏡（Leica）；凝膠化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（AZURE Biosystems）；電泳增強型電源、電泳槽、濕轉(zhuǎn)槽和細胞計數(shù)儀（Bio-Rad）。

4　主要方法

4.1CCK-8法篩選藥物濃度用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液制備BV2細胞懸液，使得細胞計數(shù)為5×108/L，然后接種到96孔板中，每孔100 μL。設(shè)置正常組和不同濃度TAS組；不同濃度TAS組每孔內(nèi)分別加入200、100、75、50、25和5 mg/L的TAS，正常組僅加入培養(yǎng)液，同樣的樣本做6個重復(fù)，培養(yǎng)24 h。在進行CCK-8法檢測細胞活力之前，將96孔板放在倒置顯微鏡下觀察細胞的數(shù)量與形態(tài)。觀察完畢后吸取上清，每孔加入培養(yǎng)液100 μL，再加入10 μL的CCK-8溶液；同時設(shè)置空白對照組，只加入100 μL的培養(yǎng)液和10 μL的CCK-8溶液。加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板，放入細胞培養(yǎng)箱避光孵育1 h，之后在450 nm波長下讀取吸光度（）。

4.2CCK-8法測定藥物對炎癥刺激后BV2細胞活力的抑制制備BV2細胞懸液（5×108/L）并接種到96孔板中。設(shè)置正常組、LPS組、高劑量TAS組和低劑量TAS組。正常組僅加入培養(yǎng)液作為對照；LPS組中LPS的濃度為1 mg/L［16］；高、低劑量TAS組細胞先分別用75和50 mg/L的TAS預(yù)保護1 h［17］，再加入1 mg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h。CCK-8法檢測步驟同4.1。

4.3流式細胞術(shù)檢測CD16/32的表達用6孔板培養(yǎng)細胞，每孔1 000 μL細胞懸液，使得細胞計數(shù)為2×109/L。細胞分組、藥物濃度設(shè)置、預(yù)給藥保護方法與培養(yǎng)時間同4.2。PBS清洗細胞2次，吹打后離心收集細胞，棄上清，用0.1% BSA重懸細胞。加入2 μL的抗CD16/32抗體，混勻、避光孵育30 min。200 g離心10 min，棄上清，用PBS重懸細胞，上機檢測，4個組設(shè)定上樣體積為50 μL，檢測細胞數(shù)量為1×108/L。

4.4Western blot檢測IL-1β和TNF-α表達細胞分組與用藥處理同4.2，用60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)BV2細胞，收集細胞后，每皿加入150 μL RIPA裂解液，4 ℃裂解細胞20 min，10 000×離心30 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，確定上樣量為30～40 μg。先通過80 V電壓電泳20 min，再用120 V電壓進行電泳1.5 h，200 mA濕轉(zhuǎn)PVDF膜1.5 h。5%的脫脂奶封閉1 h，用TBST洗膜3次。以1∶1 000的比例在4 ℃冰箱過夜孵育抗IL-1β、TNF-α和β-actin抗體。次日取出后，將膜用TBST清洗3次，以1∶2 000的比例室溫孵育HRP標記的羊抗鼠、驢抗兔Ⅱ抗2 h，再次洗膜，用ECL化學(xué)顯色后曝光檢測條帶灰度表達。

4.5免疫熒光染色細胞處理方法同4.2，但分組僅保留正常組、LPS組和低劑量用藥組。將各組細胞爬片用PBS清洗，用組織固定液室溫固定15 min，0.3% Triton X-100處理30 min，并用1% BSA封閉0.5 h。然后用稀釋比例均為1∶400的抗Iba-1、Arg-1和iNOS抗體置于4 °C冰箱內(nèi)孵育24 h。用PBS洗3遍后，用Alexa Fluor 594標記的山羊抗兔IgG（1∶400）和Alexa Fluor 488標記的驢抗鼠IgG（1∶400）在室溫下避光2 h進行染色。載玻片上滴上熒光抗淬滅液后，蓋上細胞爬片，置于正置熒光顯微鏡下進行觀察。保證采集的每幅圖像細胞數(shù)目相同。用ImageJ軟件分析各組免疫熒光圖的平均吸光度，最后匯總進行統(tǒng)計學(xué)分析。

4.6Western blot檢測NF-κB通路相關(guān)蛋白細胞蛋白提取，BCA法測定蛋白濃度，電泳及分組等方法同4.4。選擇抗TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65和β-actin抗體，稀釋比例為1∶2 000。

5　統(tǒng)計學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析，多重比較用SNK-檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義［18］。

結(jié)果

1　TAS劑量在200 mg/L時顯著抑制BV2細胞活力

經(jīng)過6種不同濃度的TAS處理BV2細胞24 h后，細胞活力整體趨勢同拋物線，在200 mg/L組中達到最低，在50 mg/L組中達到最高；與正常組比較，200 mg/L TAS顯著抑制了細胞活力（<0.05），而75 mg/L和50 mg/L組細胞活力顯著增強（<0.05），見圖1。不同濃度的TAS對BV2細胞形態(tài)和數(shù)量的影響見圖2。由于75和50 mg/L TAS能增強細胞活力，因此在后續(xù)實驗中選擇這兩個濃度為高、低劑量。

Figure 1.Effects of total Astragalus saponins （TAS） at different concentrations for 24 h on the viability of BV2 cells. Mean±SD. n=6. *P<0.05，**P<0.01 vs normal group.

Figure 2.Morphological changes and quantity of BV2 cells after treatment with total Astragalus saponins （TAS）. The scale bar=20 μm）.

2　TAS抑制炎癥刺激后BV2細胞活力

與正常組比較，LPS組BV2細胞活力顯著增強（<0.05）；與LPS組比較，高劑量TAS能顯著減弱BV2細胞活力（<0.05），低劑量TAS組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（>0.05），見圖3。

3　TAS降低BV2細胞CD16/32的表達

與正常組比較，LPS組CD16/32陽性表達細胞數(shù)增高（<0.05）；高、低劑量TAS組CD16/32的陽性表達細胞數(shù)量顯著低于LPS組（<0.05），見圖4。

4　TAS抑制炎癥細胞因子表達

高、低劑量TAS組TNF-α的表達量顯著低于LPS組（<0.05）；與LPS組相比，高、低劑量TAS組IL-1β的表達量顯著下降（<0.05）；與正常組相比，LPS組IL-1β和TNF-α的表達量均顯著增高（<0.05），見圖5。

Figure 5.Effect of total Astragalus saponins （TAS） on expression of inflammatory factors IL-1β and TNF-α. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs normal group，； **P<0.01 vs LPS （1 mg/L） group.

5　TAS影響B(tài)V2細胞iNOS和Arg-1的表達

與LPS組比較，低劑量TAS組iNOS的表達顯著下降（0.05），Arg-1的表達顯著升高（0.05）；LPS組iNOS和Arg-1的表達與正常組比較均有顯著改變，LPS組iNOS表達高于正常組（0.05），Arg-1表達低正常組（0.05），見圖6。

Figure 6.Effect of 50 mg/L total Astragalus saponins （TAS） on the expression of iNOS （A） and Arg-1 （B） in BV2 cells （immunofluorescence staining，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs normal group； **P<0.01 vs LPS （1 mg/L） group.

6　TAS抑制炎癥信號分子的蛋白水平

高、低劑量TAS組TLR-4、MyD88、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平均比LPS組顯著降低（0.05）；LPS組上述各項指標均顯著高于正常組（<0.05），見圖7。

Figure 7.Effect of total Astragalus saponins （TAS） on TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway detected by Western blot. Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs normal group； *P<0.05，**P<0.01 vs LPS （1 mg/L） group.

討論

隨著人口老齡化的到來，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)越來越高。疾病給患者及其家庭帶來了負擔，而且對全球醫(yī)療資源與經(jīng)濟影響巨大［19-20］。中藥因其多靶點、整體調(diào)節(jié)的特點，在治療和預(yù)防神經(jīng)退行性疾病具有一定優(yōu)勢［21］。

許多學(xué)者認為，小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病的進程中發(fā)揮了重要的作用。CNS內(nèi)小膠質(zhì)細胞發(fā)生的神經(jīng)炎癥將影響神經(jīng)細胞的生死存亡，所以抑制小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥是很有潛力的治療策略［22］。

小膠質(zhì)細胞是CNS中的固有免疫細胞，與其他腦細胞不同，小膠質(zhì)細胞與外周巨噬細胞有著共同的起源，并且具有強大的再生能力，能夠維持足夠數(shù)量來執(zhí)行其功能。在正常大腦中，這些細胞在靜止狀態(tài)和前哨狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)換；一旦有炎癥發(fā)生，小膠質(zhì)細胞會向激活表型（M1型）轉(zhuǎn)化，此后細胞形態(tài)迅速變化，其特征是細長的突起收縮，并逐漸變成阿米巴蟲樣［23］。本實驗表明，LPS刺激BV2細胞后，細胞發(fā)生顯著的炎癥反應(yīng)；給予75 mg/L的TAS后，細胞的炎癥反應(yīng)顯著下降，TAS可抑制炎癥反應(yīng)。

CD16/32、iNOS和IL-1β通常作為M1型小膠質(zhì)細胞的標志物，在該表型中，細胞會增加炎癥細胞因子的分泌，如IL-1β、IL-6和TNF-α，以及導(dǎo)致神經(jīng)炎癥相關(guān)酶的合成，如iNOS、環(huán)加氧酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶等［24］。在本實驗中，BV2細胞受到LPS刺激后iNOS表達增加，iNOS的異常高表達可使腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌下調(diào)，加重神經(jīng)退變［25］。炎癥因子IL-1β可以造成細胞內(nèi)鈣超載，加強炎癥因子的合成與釋放，破壞CNS內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子，在多種疾病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用［26］。在TAS干預(yù)下，CD16/32陽性細胞數(shù)量減少，炎癥因子IL-1β和TNF-α釋放減少，炎癥相關(guān)酶iNOS表達降低，M1型BV2細胞數(shù)量減少，減輕了對CNS的破壞，緩解炎癥進程。

靜息態(tài)的小膠質(zhì)細胞在適當?shù)母深A(yù)下會向具有抗炎作用的M2型細胞極化。該類型小膠質(zhì)細胞的標志物有Arg-1、IL-4及CD206［27］。以Arg-1為例，Arg-1不僅能夠阻斷髓鞘相關(guān)糖蛋白誘導(dǎo)的髓鞘再生抑制［28］。而且能夠通過協(xié)同其他細胞因子來改善CNS內(nèi)環(huán)境，保護神經(jīng)元細胞，促進軸突與髓鞘的修復(fù)。本實驗中高、低劑量TAS均能提高BV2細胞Arg-1的表達，增加M2型細胞數(shù)量，發(fā)揮抗炎作用。

TLR4屬于TLRs家族，TLR4被LPS激活后觸發(fā)銜接蛋白MyD88；作為先天免疫信號途徑的核心參與者，MyD88通過同型蛋白之間的相互作用，將IL-1受體（IL-1 receptor，IL-1R）或TLRs，與IL-1R相關(guān)激酶（IL-1R-associated kinase，IRAK）家族聯(lián)系起來，這其中也包括NF-κB的激活［29］。NF-κB的經(jīng)典通路主要是由病原體和炎癥介質(zhì)激活而成，通過經(jīng)典途徑主要激活的是p65和p50異二聚體［30］。NF-κB p65/p50的激活是許多慢性疾病如阿爾茨海默病和多發(fā)性硬化等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制中不可缺少的部分。因此，作為免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，NF-κB p65信號通路已成為許多藥物研發(fā)的關(guān)鍵點。在本實驗中，LPS組BV2細胞TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB p65蛋白水平均顯著升高；給予高、低劑量的TAS后，上述指標均顯著下降。

TAS通過多靶點進行免疫調(diào)節(jié)：減少炎癥因子和炎癥小體的釋放，促進小膠質(zhì)細胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，緩解各種致病因素對血腦屏障的破壞［3］。雖然，TAS對信號通路的影響通往往是間接性的，但仍有學(xué)者認為TAS中單體成分黃芪甲苷可以直接作用并激活糖皮質(zhì)激素受體，抑制NF-κB與DNA結(jié)合，阻斷其促炎作用，或者作為轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白的底物來發(fā)揮抗炎效應(yīng)，最終抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡，有利于神經(jīng)細胞功能恢復(fù)［31-32］。

綜上所述，TAS降低BV2細胞CD16/32和iNOS的表達，減少M1型細胞數(shù)量，并提高Arg-1的表達，增加M2型細胞數(shù)量，進而減輕細胞的炎癥反應(yīng)。其機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活、減少下游NF-κB進入細胞核轉(zhuǎn)錄、最后降低炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達有關(guān)。

［1］邊亞倩，李晶，彭莎，等. 基于系統(tǒng)中藥學(xué)的黃芪補氣潛在功效標志物的發(fā)掘［J］. 中國中藥雜志，2020，45（14）：3266-3274.

Bian YQ，Li J，Peng S，et al. Exploration of potential efficacy markers of Astragali Radix for invigorating Qi based on systematic traditional Chinese medicine［J］. Chin J Chin Mater Med，2020，45（14）：3266-3274.

［2］馬園園，王靜，羅瓊，等. 黃芪總皂苷藥理作用研究進展［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，22（7）：153-157.

Ma YY，Wang J，Luo Q，et al. Pharmacological effects and research progress of totalsaponins［J］. J Liaoning Univ Tradit Chin Med，2020，22（7）：153-157.

［31］ 徐锘，吳曉俊. 黃芪皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥理作用研究進展［J］. 中國中藥雜志，2021，46（18）：4674-4682.

Xu N，Wu XJ. Research advance of the pharmacological effects of astragalosides on nervous system diseases［J］. Chin J Chin Mater Med，2021，46（18）：4674-4682.

［4］李媛，靳曉飛，周曉紅，等. 黃芪甲苷對腦缺血/再灌注損傷大鼠細胞自噬的影響［J］. 中國病理生理雜志，2018，34（11）：2037-2042.

Li Y，Jin XF，Zhou XH，et al. Effects of astragaloside IV on autophagy in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury［J］. Chin J Pathophysiol，2018，34（11）：2037-2042.

［5］高旅，吳麗萍，史正剛，等. 中藥調(diào)控血腦屏障通透性的作用研究進展［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2019，25（20）：200-207.

Gao L，Wu LP，Shi ZG，et al. Research progress on effect of traditional Chinese medicine on blood-brain barrier permeability［J］. Chin J Exp Tradit Med Formulae，2019，25（20）：200-207.

［6］ Qi Y，Gao F，Hou L，et al. Anti-inflammatory and immunostimulatory activities of astragalosides［J］. Am J Chin Med，2017，45（6）：1157-1167.

［7］ He YX，Du M，Shi HL，et al. Astragalosides from Radix Astragali benefits experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice at multiple levels［J］. BMC Complement Altern Med，2014，14：313.

［8］ Das A，Kim SH，Arifuzzaman S，et al. Transcriptome sequencing reveals that LPS-triggered transcriptional responses in established microglia BV2 cell lines are poorly representative of primary microglia［J］. J Neuro Inflammation，2016，13（1）：182.

［9］ Kumar A，Stoica BA，Loane DJ，et al. Microglial-derived microparticles mediate neuroinflammation after traumatic brain injury［J］. J Neuroinflammation，2017，14（1）：47.

［10］ Ciesielska A，Matyjek M，Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling［J］. Cell Mol Life Sci，2021，78（4）：1233-1261.

［11］ 鄭心甜，甘海燕，李琳，等. 黃芪甲苷通過促進小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞M2型極化抑制大鼠腦缺血后炎癥反應(yīng)［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2020，49（6）：679-686.

Zheng XT，Gan HY，Li L，et al. Astragaloside IV inhibits inflammation after cerebral ischemia in rats through promoting microglia/macrophage M2 polarization［J］. J Zhejiang Univ （Med Sci Ed），2020，49（6）：679-686.

［12］ 楊吉平，費琳，柴學(xué)軍，等. MyD88抑制肽對LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)的抑制作用及其機制［J］. 吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2020，46（5）：899-904，1111.

Yang JP，F(xiàn)ei L，Chai XJ，et al. Inhibitory effect of MyD88 inhibitory peptide on polarization of BV2 microglial cells induced by LPS and its mechanism［J］. J Jilin Univ （Med Ed），2020，46（5）：899-904，1111.

［13］ Stephenson J，Nutma E，van der Valk P，et al. Inflammation in CNS neurodegenerative diseases［J］. Immunology，2018，154（2）：204-219.

［14］ Nam HY，Nam JH，Yoon G，et al. Ibrutinib suppresses LPS-induced neuroinflammatory responses in BV2 microglial cells and wild-type mice［J］. J Neuroinflammation，2018，15（1）：271.

［15］ 吳非，羅濤，郭遠瑾，等. 辛伐他汀對LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細胞極化狀態(tài)的影響［J］. 卒中與神經(jīng)疾病，2013，20（4）：200-203.

Wu F，Luo T，Guo YJ，et al. Simvastatin affect the polarization state of LPS stimulated BV2 microglia［J］. Stroke Neurol Dis，2013，20（4）：200-203.

［16］ 望金欣，王婷，趙晴晴，等. 竹節(jié)參乙酸乙酯提取物對脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的影響及其機制研究［J］. 中藥新藥與臨床藥理，2020，31（9）：1001-1007.

Wang JX，Wang T，Zhao QQ，et al. Ethyl acetate extract ofalleviates LPS-induced inflammation in BV2 cells［J］. N Chin Med Clin Pharmacol，2020，31（9）：1001-1007.

［17］ 程林，可紅. Dectin-1/Syk信號通路介導(dǎo)脂多糖誘導(dǎo)的BV2細胞中的炎癥反應(yīng)［J］. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2021，52（1）：71-75.

Cheng L，Ke H. Dectin-1/Syk signaling triggers inflammation after lipopolysaccharide stimulation in BV2 cells［J］. J Shanxi Med Univ，2021，52（1）：71-75.

［18］ 喻晶，張宜，刁波. JAK-STAT信號通路、IL-1β和IL-6在X射線輻照誘導(dǎo)PC12細胞損傷中的調(diào)控作用［J］. 中國病理生理雜志，2017，33（1）：174-178.

Yu J，Zhang Y，Diao B. Effects of JAK-STAT signaling pathway，IL-1β and IL-6 on injury of PC12 cells with X-ray irradiation［J］. Chin J Pathophysiol，2017，33（1）：174-178.

［19］ 黃貞偉，張慶，黃莉莉，等. 片仔癀通過抑制TLR4/MAPK信號通路減輕LPS誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥損傷研究［J］. 康復(fù)學(xué)報，2021，31（1）：44-51.

Huang ZW，Zhang Q，Huang LL，et al. PienTze Huang attenuates neuro-inflammatory injury in BV2 microglial cells induced by lipopolysaccharide via inhibition of TLR4/MAPK signaling pathway［J］. J Rehabil，2021，31（1）：44-51.

［20］ Katsnelson A，De Strooper B，Zoghbi HY. Neurodegeneration： from cellular concepts to clinical applications［J］. Sci Transl Med，2016，8（364）：364ps18.

［21］ Cho KJ，Trzaska KA，Greco SJ，et al. Neurons derived from human mesenchymal stem cells show synaptic transmission and can be induced to produce the neurotransmitter substance P by interleukin-1α［J］. Stem cells，2005，23（3）：383-391.

［22］ 劉宏帥，石海蓮，高雅嬋，等. 神經(jīng)炎癥與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系及中藥調(diào)控作用研究進展［J］. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，30（5）：82-89.

Liu HS，Shi HL，Gao YC，et al. Review on the relationship between neuroinflammation and neurodegenerative diseases and the effect of traditional chinese medicine［J］. J Shanghai Univ Tradit Chin Med，2016，30（5）：82-89.

［23］ Ismail EN，Jantan I，Vidyadaran S，et al. Phyllanthus amarus prevents LPS-mediated BV2 microglial activation via MyD88 and NF-κB signaling pathways［J］. BMC Complement Med Ther，2020，20（1）：202.

［24］ Troubat R，Barone P，Leman S，et al. Neuroinflammation and depression： a review［J］. Eur J Neurosci，2021，53（1）：151-171.

［25］ Tse JKY. Gut microbiota，nitric oxide，and microglia as prerequisites for neurodegenerative disorders［J］. ACS Chem Neurosci，2017，8（7）：1438-1447.

［26］ Hickman S，Izzy S，Sen P，et al. Microglia in neurodegeneration［J］. Nat Neurosci，2018，21（10）：1359-1369.

［27］ Peng J，Wang K，Xiang W，et al. Rosiglitazone polarizes microglia and protects against pilocarpine-induced status epilepticus［J］. CNS Neurosci Ther，2019，25（12）：1363-1372.

［28］ Lange PS，Langley B，Lu P，et al. Novel roles for arginase in cell survival，regeneration，and translation in the central nervous system［J］. J Nutr. 2004，134（10 Suppl）：2812S-2819S.

［29］ Deguine J，Barton GM. MyD88： a central player in innate immune signaling［J］. F1000Prime Rep，2014，6：97.

［30］ Giridharan S，Srinivasan M. Mechanisms of NF-κB p65 and strategies for therapeutic manipulation［J］. J Inflamm Res，2018，11：407-419.

［31］ Liu HS，Shi HL，Huang F，et al. Astragaloside IV inhibits microglia activation via glucocorticoid receptor mediated signaling pathway［J］. Sci Rep，2016，6：19137.

［32］ Zhang W，Liu M，Yang L，et al. P-glycoprotein inhibitor tariquidar potentiates efficacy of astragaloside IV in experimental autoimmune encephalomyelitis mice［J］. Molecules，2019，24（3）：561.

Anti-inflammatory mechanism of totalsaponins in LPS-induced BV2 cells

KANG Dong-kun1，GAO Wai-mao1▲，ZHANG Hong-zhen1，CHAI Zhi1，F(xiàn)AN Hui-jie1，XIAO Bao-guo3，MA Cun-gen1，2△，LIU Jian-chun1△

（1，，，030619，；2，，，037009，；3，，，200025，）

To explore the effects of totalsaponins （TAS） on microglia BV2 cells treated with lipopolysaccharide （LPS）.The BV2 cells were treated with LPS at a concentration of 1 mg/L for 24 h to establish an inflammatory cell model. The cells were divided into normal group，model group，high-dose （75 mg/L） TAS group and low-dose （50 mg/L） TAS group. The expression of CD16/32 was analyzed by flow cytometry. Immunofluorescence staining was used to detect the fluorescence intensity of intracellular inducible nitric oxide synthase （iNOS） and arginase-1 （Arg-1）. The protein levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α），interleukin-1β （IL-1β），Toll-like receptor 4 （TLR4），myeloid differentiation factor 88 （MyD88），nuclear factor-κB （NF-κB） p65 and phosphorylated NF-κB （p-NF-κB） p65 were determined by Western blot.Treatment with TAS at 200 mg/L exerted a significant inhibitory effect on BV2 cell viability. High-dose TAS significantly reduced the enhanced viability of BV2 cells caused by LPS. High- and low-dose TAS significantly reduced the number of CD16/32-positive cells. Immunofluorescence staining showed that TAS at low dose significantly inhibited the expression of iNOS and significantly increased the expression of Arg-1. Treatment with TAS at high or low dose suppressed the protein levels of TNF-α，IL-1β，TLR4，MyD88，NF-κB p65 and p-NF-κB p65.High- and low-dose TAS may inhibit the polarization of BV2 cells to M1 phenotype，and reduce the inflammatory cytokines through the inhibition of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway.

Totalsaponins； Microglia； Lipopolysaccharides； Inflammation； TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway

R329.21； R285.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.011

1000-4718（2022）02-0276-08

2021-07-21

2021-11-26

［基金項目］山西省中醫(yī)藥管理局科研課題項目（No. 2020ZYYC007）；山西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（No. 2020422）；山西中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新培育計劃項目（No. 2019PY-027）；山西中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新能力培育項目（No. 2020PY-YC-25）；山西省黃芪資源產(chǎn)業(yè)化及產(chǎn)業(yè)國際化協(xié)同創(chuàng)新中心子課題（No.HQXTCXZX2016-020）；山西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費；山西省衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)科技領(lǐng)軍團隊（No. 2020TD05）

馬存根 Tel： 0351-3179702； E-mail: macungen2001@163.com； 劉建春Tel: 0351-3179702； E-mail: liujc68@163.com

▲并列第一作者

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）