燕 燕， 崔傳舉， 王玉香， 李艾帆

(鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450000)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床主要采用口服黑質(zhì)多巴胺前體藥物進行治療，但長期服藥治療效果降低，還可引起運動障礙等并發(fā)癥[1]。臍血干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs)中含有神經(jīng)、造血等多種干細胞，并將其運用于誘導分化多巴胺能神經(jīng)元，從而治療PD[2-5]。但UMSCs是否可作為PD細胞替代治療的理想細胞尚存在爭議。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)可參與神經(jīng)細胞生長、增殖及分化等過程，并可保護間充質(zhì)干細胞，從而促進其增殖及分化[6]。因此，本研究主要探究NGF過表達的UMSCs移植對PD大鼠的治療效果，為臨床中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療及預(yù)防提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 36只雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)：2012-0003。UMSCs購自中國醫(yī)學科學院血液學研究所；pcDNA3.1購自武漢淼靈生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自北京索萊寶科技有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗鼠NGF抗體購自北京義翹神州科技有限公司；兔抗鼠Tribbles同源蛋白3(TRB3)抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化試劑盒購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 建立PD模型 選取9只大鼠，經(jīng)腹腔注射質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛溶液，腦部剔除毛發(fā)后消毒，切開腦部組織，選取前腦內(nèi)側(cè)束與右側(cè)黑質(zhì)致密部各一點，切開顱骨，每點注射4 μL的六羥多巴胺溶液，留針約8 min，以1 mm·min-1的速度緩慢退針，使用少量青霉素撒至腦部切口，縫合，7 d內(nèi)進行傷口酒精消毒及腹腔注射青霉素，7 d后腹腔注射阿撲嗎啡(APO)，觀察大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，向左旋轉(zhuǎn)360°記為一圈，記錄30 min內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，若大鼠30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于180圈，表明PD大鼠建模成功[7]。

1.2.2 NGF轉(zhuǎn)染及UMSCs處理 UMSCs生長至80%融合時，使用PBS洗滌，加入胰蛋白酶消化，加入質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，制備細胞懸液，收集細胞置于離心管內(nèi)，4 ℃條件下1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入含有質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基垂懸細胞，細胞按照1∶3傳代培養(yǎng)，每隔24 h更換一次培養(yǎng)液。取第5代UMSCs，調(diào)整細胞密度為5×106個·L-1，接種于6孔板(每孔150 μL)，加入重組人表皮生長因子(20 μg·L-1)與重組人堿性成纖維細胞生長因子(20 μg·L-1)預(yù)誘導24 h，加入全反式視黃酸(1 μmol·L-1)誘導15 min，加入膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子繼續(xù)誘導5 h，終止誘導。取對數(shù)期UMSCs，分別將pcDNA-NC、pcDNA-NGF轉(zhuǎn)染至誘導后的UMSCs中[8]，分為pcDNA-NC組和pcDNA-NGF組，轉(zhuǎn)染過程參照Lipofectamine2000試劑說明書，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞。實驗設(shè)置NC組(大鼠僅進行手術(shù)，不進行注射)、PD組(PD模型)、UMSCs組(正常大鼠中經(jīng)皮下注射含有pcDNA-NGF的UMSCs細胞懸液至腦部黑質(zhì)區(qū))、UMSCs+PD組(PD模型大鼠中經(jīng)皮下注射含有pcDNA-NGF的UMSCs細胞懸液至腦部黑質(zhì)區(qū))，每組各9只。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測相關(guān)指標 采用Trizol法提取各組細胞或腦組織中的總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計測定RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。NGF正向引物5’-CAGGAGCAAGCGGTCATCA-3’，反向引物5’-GGTCTTATCCCCAACCCACA-3’；GFAP正向引物5’-CACTCAATGCTGGCTTCA-3’，反向引物5’-GCGACTCAATCTTCCTCTC-3’；MAP2正向引物5’-AACACGACACAACGAACT-3’，反向引物5’-TGGAGAAGGAGGCAGATTA-3’；Tubulin正向引物5’-ACACGGATGAGACCTACT-3’，反向引物5’-TGTTCTTGCTCTGGATGG-3’；TRB3正向引物5’-GAAGAAGCAGCAAGAGAGGC-3’，反向引物5’-ACACTGCGGCGATTGTAAAA-3’；β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，去離子水(ddH2O)補足至總體積20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40次。NGF、Nestin、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元細胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白 2 (MAP2)、微管蛋白(Tubulin)、TRB3均以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算NGF、巢蛋白(Nestin)、GFAP、 MAP2、Tubulin、TRB3 mRNA的相對表達量。

1.2.4 免疫組化法檢測黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞計數(shù) 各組大鼠培養(yǎng)4周后，采用脫頸法處死大鼠，使用質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定，取各組大鼠腦組織，石蠟包埋，經(jīng)脫蠟、脫水處理后，加入檸檬酸緩沖液進行熱抗原修復15 min，室溫冷卻，使用PBS緩沖液洗滌3 min，參照免疫組化試劑盒說明書進行TH染色，切片復染、脫水處理后使用中性樹脂封片，置于纖維鏡下觀察結(jié)果，分別計數(shù)TH陽性細胞數(shù)[9]，細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒記為陽性細胞。

1.2.5 觀察指標 觀察各組大鼠治療4周的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)記錄，記錄時間為30 min。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測NGF、TRB3蛋白表達 收集各組UMSCs及大鼠腦組織(黑質(zhì)區(qū))，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min提取細胞或組織總蛋白。采用BCA法檢測蛋白濃度。將30 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻后點樣，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入NGF(1∶1 000)、TRB3(1∶1 000)一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌，加入二抗稀釋液(1∶2 000)，滴加ECL顯影，采用Quantityone軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞計數(shù)比較 與NC組比較，PD組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增多(P<0.05)；與UMSCs組比較，UMSCs+PD組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)增多(P<0.05)；與PD組比較，UMSCs+PD組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少(P<0.05)。與NC組比較，大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞計數(shù)減少(P<0.05)；與PD組比較，UMSCs+PD組大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞計數(shù)增多(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)和TH陽性細胞計數(shù)比較

2.2 UMSCs中過表達NGF后神經(jīng)譜系標志物Nestin、GFAP、MAP2、Tubulin mRNA的表達水平比較 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-NGF組NGF mRNA及蛋白、Nestin、GFAP、MAP2、Tubulin mRNA的表達水平升高(P<0.05)。見圖1。

2.3 過表達NGF的UMSCs處理PD大鼠腦組織中TRB3的表達水平 與NC組比較，PD組大鼠腦組織中TRB3 mRNA及蛋白表達水平升高(P<0.05)；與PD組比較，UMSCs+PD組大鼠腦組織中TRB3 mRNA及蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖2。

注：A：qRT-PCR檢測NGF mRNA表達水平；B：qRT-PCR檢測Nestin mRNA表達水平；C：qRT-PCR檢測GFAP mRNA表達水平；D：qRT-PCR檢測MAP2 mRNA表達水平；E：qRT-PCR檢測Tubulin mRNA表達水平；F、G：Western blot檢測NGF蛋白的表達。與pcDNA-NC組比較，t=13.282,10.075,7.340*,9.699,9.112,15.230，P<0.05。

注：A：qRT-PCR檢測TRB3 mRNA表達水平；B、C：Western Blot檢測TRB3蛋白的表達。與NC組比較，*P<0.05；與PD組比較，#P<0.05。

3 討論

既往研究[10]顯示,骨髓間充質(zhì)干細胞移植可有效改善PD模型大鼠的行為學癥狀。膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾神經(jīng)干細胞移植可促進細胞存活從而改善PD大鼠的運動障礙[11]。干細胞移植可抑制腦黑質(zhì)部多巴胺能神經(jīng)元凋亡，從而恢復神經(jīng)中樞系統(tǒng)中多巴胺遞質(zhì)的水平，最終達到治療PD的目的。因而從分子水平調(diào)控基因表達，可能會提高PD治療效果。

NGF聯(lián)合人臍帶間充質(zhì)干細胞移植可減輕缺血、缺氧腦損傷大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，并可恢復中樞神經(jīng)功能[12]。有研究[13]表明，NGF可在體外誘導區(qū)來源神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元。相關(guān)報道指出，NGF表達量升高可促進移植脂肪干細胞分化，并可促進動物模型腦損傷后功能的恢復[14]。本研究結(jié)果顯示，UMSCs中NGF過表達后可促進神經(jīng)譜系標志物Nestin、GFAP、MAP2、Tubulin mRNA的表達，提示UMSCs中NGF表達量升高可促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及細胞分化。有研究[15-17]表明，神經(jīng)特異性蛋白Nestin、GFAP、MAP2、Tubulin在神經(jīng)干細胞的分化及增殖過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，NGF過表達能促進UMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化，UMSCs移植后PD大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減少，大鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞計數(shù)增多，提示PD模型中NGF過表達修飾的UMSCs能夠促進NGF表達，從而促使多巴胺能神經(jīng)元替代受損的多巴胺能神經(jīng)元，并可能抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡。有研究[18-19]表明，TRB3屬于激酶類似蛋白，其可與蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT)結(jié)合從而參與細胞凋亡過程，還可參與缺血再灌注后神經(jīng)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過程，并可有效改善大鼠胰島素抵抗。本研究結(jié)果顯示，PD模型大鼠腦組織中TRB3的表達水平升高，過表達NGF的UMSCs處理PD大鼠后，腦組織中TRB3的表達水平降低，提示UMSCs細胞可能促進NGF表達而抑制TRB3表達，減輕PD模型大鼠神經(jīng)功能損傷。

綜上所述，NGF過表達轉(zhuǎn)染UMSCs可促進細胞向神經(jīng)元樣分化，并可保護受損神經(jīng)元，UMSCs移植可改善PD模型大鼠的癥狀，NGF聯(lián)合UMSCs動物體內(nèi)移植的實驗研究，為中樞神經(jīng)損傷的修復及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷并發(fā)癥的預(yù)防提供新途徑，可為PD等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細胞治療及基因治療奠定理論基礎(chǔ)。