楊佳璇 李明浩 李艾靜 葉璐夷

由于稀有血型個體的血液資源有限，需要依賴于稀有血型庫和低溫保存獻血者的血液[1]，并且用于鑒定抗高頻抗原抗體的陰性試劑細胞不易獲取。目前，布里斯托大學的科研人員[2]利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）基因編輯工具，在紅系細胞中敲除ABO、Rh、Kell、Duffy等常見的引起輸血不相容的血型系統(tǒng)的基因，重構(gòu)血型抗原的表型，以期制備出滿足不同輸血需求的可定制化紅細胞以降低同種免疫反應(yīng)的發(fā)生，這將具有極大的臨床意義。

基于此，我們嘗試利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除編碼Vel高頻抗原的基因。Vel血型抗原在人群中的比例高達99.9%以上[3]，該抗原由SMIM1基因編碼，組成該基因的4個外顯子中，僅第3號和4號外顯子編碼功能蛋白[4]。當3號外顯子上第64至80位缺失17bp堿基發(fā)生純和缺失突變時，會導(dǎo)致蛋白翻譯讀碼框改變，提前終止翻譯，產(chǎn)生了Vel（-）的稀有表型，該突變在Vel（-）個體中占據(jù)主體地位[4]。白種人群中發(fā)生17bp堿基缺失突變的頻率為1.46%，非洲人群中的頻率為0.56%[3]。作者所在單位團隊曾在上海地區(qū)6 153名獻血者中篩查出2名Vel（-）獻血者[5]。而新疆伊犁地區(qū)3 328名獻血者中有14名為缺失17bp堿基的雜合突變[6]。盡管我國對該表型的研究較少，但是由于同種免疫產(chǎn)生的抗-Vel抗體可造成血管內(nèi)溶血和新生兒溶血病[7]，檢測抗-Vel抗體所需的試劑紅細胞也不易獲取，這都對Vel（-）個體的輸血產(chǎn)生不利影響。因此如果能夠重構(gòu)Vel血型抗原的表型，將為Vel（-）個體抗體鑒定和配血困難提供一個新的解決途徑。

本研究選擇具有紅系分化能力的人紅白血病細胞系K562進行實驗[8]，利用易轉(zhuǎn)染的293T細胞作為初篩細胞，通過Sanger測序初步篩選具有較高切割效率的sgRNA。之后通過慢病毒介導(dǎo)的方法將篩選后的sgRNA遞送至K562細胞中，經(jīng)Sanger測序和TA克隆檢測，驗證了CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合慢病毒在K562細胞中敲除SMIM1基因的可行性，為后續(xù)構(gòu)建Vel抗原表型陰性的細胞模型奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材料與試劑 人胚腎293T細胞株和人慢性髓系白血病K562細胞株購自北納生物公司；質(zhì)粒PX458和lentiCRISPRv2序列源自張鋒實驗室。胎牛血清（貨號：10099141C）、DMEM（貨號：C11995500BT）、RPMI 1640（貨號：C11875500BT）培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胰酶EDTA溶液（貨號：S310KJ）購自上海源培生物科技股份有限公司；Xfect轉(zhuǎn)染試劑（貨號：631317）、LA Taq Hot Start Version（貨號：RR042A）購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；慢病毒滴度檢測卡（貨號：BF06202-10）購自蘇州博特龍生物科技有限公司；polybrene（貨號：TR-1003-G）購自美國Sigma公司；嘌呤霉素（貨號：60210ES25）購自上海翊圣生物科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（貨號：DP117）、細胞基因組DNA提取試劑盒（貨號：DP304）購自北京天根生化科技有限公司。PCR引物合成與測序在華大基因完成。

2 細胞培養(yǎng) 293T細胞為貼壁細胞，培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），經(jīng)胰酶消化后進行傳代。K562細胞為懸浮細胞，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。兩種細胞均置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每兩天傳代一次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

3 sgRNA設(shè)計與質(zhì)粒構(gòu)建 利用NCBI（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫獲得SMIM1基因CDS區(qū)序列，通過sgRNA在線設(shè)計網(wǎng)站（http：//crispr.dfci.harvard.edu）設(shè)計5條靶向SMIM1基因3號外顯子的sgRNA序列（圖1，序列見表1）。

表1 靶向SMIM1基因3號外顯子的sgRNA序列

圖1 5條sgRNA在SMIM1基因3號外顯子中的位置圖示

合成后的sgRNA序列分別克隆到載體質(zhì)粒PX458中，構(gòu)建敲除SMIM1基因并表達綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的基因編輯元件，用以篩選具有高效切割效率的sgRNA序列。將篩選后的sgRNA序列克隆至載體質(zhì)粒lentiCRISPRv2中，用于慢病毒的包裝制備。質(zhì)粒構(gòu)建由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

將構(gòu)建完成質(zhì)粒的甘油菌接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后，使用無內(nèi)毒素大提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，測得質(zhì)粒DNA濃度均接近于1 μg/μL，260/280比值范圍在1.98～2.00之間。

4 轉(zhuǎn)染 293T細胞于轉(zhuǎn)染前一天鋪種，K562細胞轉(zhuǎn)染當天處理，細胞均接種于24孔細胞培養(yǎng)板中。顯微鏡下觀察細胞的狀態(tài)和密度，選擇生長狀態(tài)良好、密度在70%～80%的細胞用于轉(zhuǎn)染。以單個孔為例，取1 μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒加入至25 μL的Xfect反應(yīng)緩沖液中，振蕩混勻5秒后向其中加入0.3 μL的Xfect聚合物，振蕩混勻10 s。室溫孵育10 min后，將混合物加入至待轉(zhuǎn)染細胞中，輕輕混勻后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，4 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

5 慢病毒包裝與滴度檢測 使用慢病毒二代包裝系統(tǒng)（三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)），目的質(zhì)粒為lentiCRISPRv2-sgRNA4，慢病毒的結(jié)構(gòu)蛋白編碼質(zhì)粒為psPAX2，蛋白外殼編碼質(zhì)粒為pMD2.G。前一天將293T細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，當細胞密度接近70%～80%時，使用Xfect轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒質(zhì)量比例為lentiCRISPRv2∶psPAX2∶pMD2.G=12∶6∶3。轉(zhuǎn)染72 h后，收集病毒上清，用0.45 μm濾膜過濾后，25 000 r/min，4℃離心2 h得到病毒沉淀，用適宜體積的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸病毒。使用慢病毒滴度檢測卡估測病毒滴度，分裝后保存于-80℃冰箱。

6 慢病毒感染K562細胞 預(yù)先摸索K562細胞嘌呤霉素的耐藥性。調(diào)節(jié)細胞密度為5×105/mL，嘌呤霉素濃度梯度按照0、0.5、0.75、1、1.5、2 μg/mL加入細胞培養(yǎng)基中，每兩天更換相應(yīng)濃度的新鮮培養(yǎng)基。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，K562細胞經(jīng)嘌呤霉素處理7天全部死亡的最低濃度為1 μg/mL。

取對數(shù)生長期的K562細胞制成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度為5×105/mL，根據(jù)感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值為20倍加入慢病毒，同時加入polybrene（終濃度8 μg/mL）促進細胞感染，混勻后將細胞鋪種于12孔細胞培養(yǎng)板中，室溫900×g離心30 min，培養(yǎng)48 h后加入嘌呤霉素（終濃度1 μg/mL）篩選帶有抗性的細胞，并在后續(xù)培養(yǎng)過程中持續(xù)加入同濃度的嘌呤霉素。

7 PCR擴增及檢測 目的細胞嚴格按照說明書提取基因組DNA。通過PCR反應(yīng)擴增SMIM1基因3號和4號外顯子的目的序列。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括0.5 μL酶（5 U/μL）、5 μL緩沖液（10×）、8 μL dNTP（2.5 mM）、0.8 μM擴增引物、100 ng基因組DNA、雙蒸水補足體積。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 40 s，64℃ 50 s，72℃ 30 s共30個循環(huán)，后置72℃延伸7 min。將擴增產(chǎn)物委托華大基因進行Sanger測序并送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行TA克隆檢測，擴增引物序列[3，4，9]見表2，測序引物同正向擴增引物。

表2 SMIM1基因3號和4號外顯子擴增引物序列

8 數(shù)據(jù)分析 流式檢測分析轉(zhuǎn)染效率采用FlowJo V10軟件；實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法為t檢驗，繪圖使用GraphPad Prism 7軟件；序列分析采用SnapGene軟件，測序結(jié)果與SMIM1基因參考序列（NG_033869）進行比對。

結(jié) 果

1 sgRNA初篩平臺細胞系的選擇 本研究選擇貼壁生長的人胚腎293T細胞，通過Xfect試劑分別向K562和293T細胞中轉(zhuǎn)入等量的表達GFP的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，通過流式分析儀檢測細胞中GFP的表達情況。結(jié)果顯示（圖2），293T細胞組中GFP的陽性率明顯高于K562細胞組，故后續(xù)將使用293T細胞用以篩選具有高效切割效率的sgRNA。

圖2 轉(zhuǎn)染后不同細胞系的GFP表達（n=3，**P＜0.01）

2 sgRNA篩選質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 將等量的5個sgRNA篩選質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入293T細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞進行流式檢測。結(jié)果顯示（圖3），轉(zhuǎn)染組與未處理組相比，轉(zhuǎn)染組均能檢測到GFP的表達，說明Cas9-sgRNA共表達的篩選質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入293T細胞中，為敲除目的基因提供編輯元件。

圖3 293T細胞轉(zhuǎn)入sgRNA篩選質(zhì)粒后GFP的表達

3 具有高效切割效率sgRNA序列的篩選 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的工作原理，Cas9蛋白將在sgRNA識別位點處切割雙鏈DNA產(chǎn)生堿基的插入缺失（Insertion-deletion，Indel）。將轉(zhuǎn)染48小時后的細胞提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴增目的片段后進行Sanger測序，各測一個反應(yīng)，測序結(jié)果通過Synthego網(wǎng)站（https：//ice.synthego.com）分析編輯效率（Indel%）（表3）。

表3 sgRNAs的編輯效率

結(jié)果表明，在相似轉(zhuǎn)染效率的情況下，不同sgRNA序列的切割效率存在差異，因此需要建立一個有效的篩選平臺以選擇高效的sgRNA序列，以降低時間和費用成本。

4 敲除SMIM1基因K562細胞池的建立 本研究選擇編輯效率最高的sgRNA4序列包裝慢病毒后遞送至K562細胞中，感染48小時后加入嘌呤霉素藥物篩選，1周后收集1×106個細胞提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴增目的片段后進行Sanger測序。

如圖4A所示，與野生型K562細胞相比，感染組在sgRNA4識別位點下游顯示套峰，提示在該識別位點下游基因組序列存在差異。通過Synthego網(wǎng)站分析編輯效率（Indel%）為91%，說明通過慢病毒介導(dǎo)和藥物篩選的方法可以有效提高目的基因的編輯效率。由于SMIM1基因由3號和4號外顯子編碼功能蛋白，為檢測是否存在脫靶現(xiàn)象，同時對4號外顯子進行Sanger測序。與野生型基因相比，編輯后細胞SMIM1基因的4號外顯子堿基序列未發(fā)生改變（圖4B）。

圖4 慢病毒感染后K562-sgRNA4細胞池的Sanger測序峰圖

5 TA克隆檢測基因突變 由于利用CRISPR/Cas9技術(shù)在sgRNA識別位點敲除基因后產(chǎn)生的Indel是隨機的，因而在上述細胞池中編輯后的基因型是不同的。為此我們將上述PCR產(chǎn)物進行TA克隆，挑取5個克隆測序均顯示在sgRNA4識別位點附近發(fā)生突變。其中2號克隆和4號克隆兩個等位基因分別缺失2個堿基和增添1個堿基，突變導(dǎo)致終止密碼子提前，預(yù)期將影響編碼Vel抗原（圖5）。后續(xù)可以通過有限稀釋等方法獲得SMIM1基因敲除的單克隆K562細胞株。

圖5 sgRNA4識別位點附近的基因突變鑒定

綜合上述結(jié)果，本研究說明經(jīng)篩選平臺初篩的sgRNA序列，包裝慢病毒介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠成功編輯K562細胞的SMIM1基因。

討 論

通過改造血型抗原的表達提高紅細胞的輸血相容性并不是全新的概念。早有學者嘗試使用糖苷酶遮蔽抗原以轉(zhuǎn)換ABO血型[10]。近年來，研究者們利用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNAs降低造血干細胞中血型抗原的表達，在常規(guī)的紅細胞凝集實驗中，修飾后的細胞與相應(yīng)抗原表型陰性的細胞表現(xiàn)出相同的反應(yīng)現(xiàn)象[11]。但由于是不完全的敲除，殘留的抗原可能仍會引起同種抗體的產(chǎn)生，并且造血干細胞的擴增能力有限，需不斷轉(zhuǎn)導(dǎo)shRNA以獲得一定數(shù)量的修飾細胞。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，國外有學者[12]利用TALENs（transcription activator-like effector nucleases）技術(shù)在RhD陽性的紅系前體細胞中敲除RHD基因，將RhD陽性細胞轉(zhuǎn)換為RhD陰性細胞，避免了重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)編輯元件的弊端。但是TALENs技術(shù)依賴于蛋白對DNA序列的識別，如果靶向不同的DNA序列，就需要重新構(gòu)建蛋白模塊，工作量大且操作復(fù)雜。而CRISPR/Cas9技術(shù)依賴于堿基間的識別，只需要改動20 bp的sgRNA序列，就可以靶向不同的基因位點。Cas9切割雙鏈DNA后，會促使細胞發(fā)生非同源末端連接的DNA修復(fù)機制，在斷裂缺口引入的突變會改變該基因的讀碼框，從而導(dǎo)致基因的敲除[13]，該技術(shù)操作步驟簡便且具有更高的編輯效率。

本研究使用的K562細胞為懸浮生長狀態(tài)，不易與轉(zhuǎn)染復(fù)合物結(jié)合，較難通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入基因編輯元件[14]，但是靶向同一基因不同位點sgRNA序列的切割效率存在差異。因此，本研究利用易轉(zhuǎn)染的293T細胞初步篩選具有高效切割效率的sgRNA，簡化操作步驟且降低實驗成本。之后利用慢病毒介導(dǎo)將篩選后的Cas9-sgRNA編輯元件遞送至K562細胞中，經(jīng)Sanger測序和TA克隆檢測，顯示編輯后的細胞在sgRNA4識別位點處發(fā)生移碼突變導(dǎo)致終止密碼子提前，突變位點（如圖5中sgRNA4-4）較目前已知的Vel（-）個體缺失17bp堿基的突變位點更靠近起始密碼子，預(yù)期將提前終止翻譯產(chǎn)生Vel（-）的表型。

本研究還存在不足之處有待進一步研究。一方面，僅在基因水平驗證了該方法可以敲除K562細胞中的SMIM1基因。由于目前作者缺乏人源抗-Vel血清和商業(yè)化的流式抗體，難以在蛋白水平進行Vel抗原表達的鑒定。后續(xù)將通過有限稀釋等方法建立單克隆細胞株，并嘗試尋找合適的抗體在蛋白水平檢測編輯后細胞的Vel抗原表型。另一方面，雖然K562細胞易于被誘導(dǎo)向紅系定向分化，細胞表面表達紅系特征的血型抗原[15]，但是其表面各種血型抗原的表達水平與紅細胞相比仍然存在差異，并且K562細胞作為腫瘤細胞也限制了其定向改造，因此需要尋找更接近紅細胞特性的永生化細胞系用于細胞模型的建立。

實際上，利用基因編輯技術(shù)改造血型抗原表型還存在更多可能。稀有血型常見于單個核苷酸突變（single nucleotide polymorphism，SNP），CRISPR/Cas9技術(shù)雖然可以實現(xiàn)基因敲除和定點修飾，但是基于同源重組機制的定點突變效率仍然偏低。近年來單堿基編輯技術(shù)發(fā)展迅速，該技術(shù)可以在不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂的情況下，將胞嘧啶轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶（C＞T）或?qū)⑾汆堰兽D(zhuǎn)換為鳥嘌呤（A＞G）[16-17]。相較于CRISPR介導(dǎo)的基因編輯，這一技術(shù)能夠精準實現(xiàn)堿基的直接轉(zhuǎn)換，大大提高了精確編輯基因的效率，有望應(yīng)用于因SNP產(chǎn)生的稀有表型的血型抗原細胞模型的建立。

綜上，本研究通過sgRNA初篩平臺篩選靶向SMIM1基因3號外顯子的高效sgRNA序列，利用慢病毒方法遞送Cas9-sgRNA元件至K562細胞中，經(jīng)Sanger測序和TA克隆檢測，證實了該方法在K562細胞中敲除SMIM1基因的可行性。后續(xù)在此基礎(chǔ)上可以構(gòu)建Vel表型陰性的細胞模型并開展對Vel血型抗原的功能研究，也可以嘗試制備該抗原表型陰性的細胞應(yīng)用于抗體鑒定試劑細胞的生產(chǎn)，為滿足Vel（-）稀有血型患者的輸血需求提供更多可能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突