国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

1例部分D表型獻(xiàn)血者RhD抗原表位及分子機(jī)制研究*

2022-02-17 07:30李明浩楊佳璇李艾靜朱自嚴(yán)葉璐夷
臨床輸血與檢驗(yàn) 2022年1期
關(guān)鍵詞:單克隆表型抗原

李明浩 楊佳璇 李艾靜 朱自嚴(yán) 葉璐夷

RH血型系統(tǒng)的D抗原是免疫原性最強(qiáng)、最具多態(tài)性、最復(fù)雜的紅細(xì)胞血型抗原之一,在臨床輸血中具有重要的臨床意義。D抗原由RHD基因編碼的RhD蛋白攜帶,單克隆抗體已確定至少有30種抗原表位[1]。RhD蛋白由位于1號(hào)染色體短臂的RHD基因編碼,其跨紅細(xì)胞膜12次,N末端和C末端位于膜內(nèi)并形成6個(gè)膜外結(jié)構(gòu)域[2]。

除常見的D陽性和D陰性表型外,還存在D變異型,包括弱D、部分D和DEL等。通常認(rèn)為,弱D表型表現(xiàn)為D抗原表達(dá)的減弱,部分D表型表現(xiàn)為D抗原表位的改變。但是兩者的界限并不明確,僅利用血清學(xué)無法區(qū)分,目前基因測序是鑒定D變異型較好的方法。RHD-CE-D基因融合、胞外環(huán)單個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變[3]都會(huì)導(dǎo)致D抗原表位缺失或影響胞外環(huán)的3D構(gòu)象,表現(xiàn)為部分D。部分D表型個(gè)體因缺失了某些D抗原表位,在接受正常RhD陽性血液時(shí)可產(chǎn)生針對(duì)所缺表位的抗體,繼而導(dǎo)致嚴(yán)重的輸血反應(yīng);而部分D表型獻(xiàn)血者的血液制品輸注給D陰性個(gè)體也有一定的幾率產(chǎn)生抗-D抗體。因此,部分D表型新RHD基因突變的發(fā)現(xiàn)對(duì)于預(yù)測輸血或妊娠中抗-D同種異體免疫的潛在風(fēng)險(xiǎn)有重要的意義。

我們通過對(duì)1例D變異型獻(xiàn)血者樣本開展血清學(xué)及基因水平研究,發(fā)現(xiàn)其RHD基因存在c.492C>G位點(diǎn)突變,從而導(dǎo)致RhD蛋白第3個(gè)胞外環(huán)編碼氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替代,表現(xiàn)為部分D表型。該突變類型目前國際上僅發(fā)現(xiàn)1例,國內(nèi)屬首次報(bào)道。對(duì)于RHD基因合子型的檢測,過去曾報(bào)道過的方法包括傳統(tǒng)的RFLP-PCR[4],實(shí)時(shí)定量PCR[5]以及最新的定量技術(shù)數(shù)字PCR[6]等。本研究采用最近發(fā)展起來的數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用于RHD基因合子型的檢測,相對(duì)于實(shí)時(shí)定量PCR方法提高了精確度。

材料與方法

1 標(biāo)本來源 血液樣本來自1例上海市血液中心無償獻(xiàn)血者,初篩為RhD陰性,ABO血型為A。隨機(jī)已知RHD基因型DNA樣本來自本實(shí)驗(yàn)室保存。該樣本相關(guān)項(xiàng)目已通過上海市血液中心醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)審批(編號(hào):SBC-IRB-2019-19)。

2 方法

2.1 檢測試劑:單克隆IgM/IgG抗-D 試劑(均購自上海血液生物醫(yī)藥公司;IgM抗-D,克隆號(hào)Rum-1;IgG抗-D,克隆號(hào)MS-26);IgG抗-D為2種不同來源的多克隆人源抗-D血清;單克隆IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e(均購自上海血液生物醫(yī)藥公司;抗-C,克隆號(hào)MS-24;抗-c,克隆號(hào)MS-33;抗-E,克隆號(hào)MS-80+258;抗-e,克隆號(hào)MS-16+21+63);血液基因組DNA提取試劑盒(購自天根生化科技有限公司;貨號(hào)DP304);抗原表位檢測試劑盒(D-screen,Diagast,法國,克隆號(hào)P3×P3×61+21223B10+P3+P3×290×35);實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增預(yù)混液(購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;貨號(hào)11184ES08);數(shù)字PCR相關(guān)試劑(購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;貨號(hào)1863023)。

2.2 血清學(xué)檢測:對(duì)該樣本采用試管法進(jìn)行CE分型、Rh陰性確認(rèn)和D抗原表位檢測。按照D-screen試劑盒說明書方法檢測樣本的D抗原表位。

2.3RHD基因測序:根據(jù)天根生物血液基因組DNA提取試劑盒說明書提取外周血白膜細(xì)胞的基因組DNA。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7-8]中的引物及擴(kuò)增方法,對(duì)RHD基因1號(hào)至10號(hào)外顯子,包括相鄰的側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并送測。PCR擴(kuò)增儀為ABI Veriti。引物合成及測序均送至上海生工生物完成。

2.4RHD雜合性分析:采用伯樂生物數(shù)字PCR探針法試劑盒,嚴(yán)格按照說明書將探針法預(yù)混反應(yīng)液、DNA模板、引物及探針配置成20 μL的PCR反應(yīng)體系,并利用微滴生成儀(伯樂,QX200)將混合的PCR反應(yīng)液分散成微滴,每個(gè)微滴作為單獨(dú)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并利用微滴讀取儀(伯樂,QX200)逐滴讀取,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的絕對(duì)定量。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃ 10 min;變性94℃ 30 s,退火延伸60℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán);酶滅活98℃ 10 min。嚴(yán)格按照擴(kuò)增方法檢測RHD基因的5號(hào)、7號(hào)外顯子并將β-ACTIN作為內(nèi)參基因,PCR擴(kuò)增引物及探針根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[9-10]。采用數(shù)字PCR方法分析該新突變樣本的RHD雜合型。同時(shí)對(duì)26例隨機(jī)已知基因型樣本分別通過數(shù)字PCR和實(shí)時(shí)定量PCR方法擴(kuò)增RHD基因5、7號(hào)外顯子及β-ACTIN基因,并比較合子型的準(zhǔn)確性及結(jié)果的離散程度。實(shí)時(shí)定量PCR儀器為羅氏LightCycler480Ⅱ,嚴(yán)格按照擴(kuò)增方法檢測RHD基因的5號(hào)、7號(hào)外顯子及內(nèi)參基因β-ACTIN,擴(kuò)增引物根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[9-11],反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃ 5 min;變性95℃10 s,退火延伸60℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。

2.5 蛋白3D模型的建立:利用Robetta同源建模網(wǎng)站(http://www.robetta.org/),將部分D型和野生型RhD蛋白的氨基酸序列導(dǎo)入網(wǎng)站,分別構(gòu)建部分D型和野生型RhD蛋白3D構(gòu)象模型。

結(jié) 果

1 血清學(xué)結(jié)果 本研究的該名獻(xiàn)血者樣本在Rh陰性確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中與單克隆IgM抗-D抗體反應(yīng)為陰性,與1種單克隆抗-D抗體、2種多克隆抗-D抗體反應(yīng)均為3+。CE分型為CcEe,詳見表1。

表1 樣本血清學(xué)分型

2 RhD抗原表位分析 使用D-Screen試劑盒分析該樣本D抗原表位分布,樣本紅細(xì)胞與針對(duì)D抗原的epD9.1、epD5.4、epD2.1和epD3.1表位的單克隆抗-D反應(yīng)呈陽性(分別為2+s、2+、2+和3+),與其他單克隆抗-D反應(yīng)均為陰性,表現(xiàn)為部分D表型,結(jié)果見表2。

表2 D抗原表位檢測

3 Sanger測序分析 對(duì)該個(gè)體RHD基因1號(hào)至10號(hào)外顯子及相鄰側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)域擴(kuò)增并測序。測序結(jié)果顯示RHD基因第4號(hào)外顯子存在c.492C>G突變,測序結(jié)果見圖1。該突變導(dǎo)致RhD蛋白第3個(gè)胞外環(huán)上164位氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替換(p.Asp164Glu)[12]。4 構(gòu)建數(shù)字PCR檢測RHD基因型的方法 利用數(shù)字PCR和實(shí)時(shí)定量PCR分別對(duì)隨機(jī)RHD純合、雜合樣本檢測RHD基因5、7號(hào)外顯子及內(nèi)參基因β-ACTIN的相對(duì)表達(dá)。

圖1 RHD基因測序結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR檢測RHD基因的相對(duì)表達(dá),其中12個(gè)純合樣本相對(duì)值在0.7~1.5之間,14個(gè)雜合樣本在0.2~0.8之間。數(shù)字PCR方法檢測RHD基因拷貝數(shù),相對(duì)于內(nèi)參基因β-ACTIN,12個(gè)純合樣本得到的比值范圍是0.9~1.1,14個(gè)雜合樣本則為0.46~0.56。其中數(shù)字PCR的結(jié)果為RHD/β-ACTIN(FAM/HEX)拷貝數(shù)的比例,實(shí)時(shí)定量PCR為2-△△CT的結(jié)果。詳見圖2。

對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR和數(shù)字PCR的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,相比于實(shí)時(shí)定量PCR,數(shù)字PCR同組樣本間的重復(fù)性較好,結(jié)果更穩(wěn)定,純合組和雜合組數(shù)據(jù)的差異顯著,詳見圖2A-D。同時(shí)分析幾組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(CV),發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR結(jié)果的CV值明顯低于實(shí)時(shí)定量PCR,提示數(shù)字PCR可以更精準(zhǔn)、穩(wěn)定地進(jìn)行RHD基因雜合性分析,結(jié)果見圖2E。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR與數(shù)字PCR檢測RHD基因相對(duì)表達(dá)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

5RHD雜合性分析 利用數(shù)字PCR檢測該例D變異型樣本RHD基因5、7號(hào)外顯子DNA水平的表達(dá),結(jié)果顯示RHD基因5、7號(hào)外顯子的拷貝數(shù)約為內(nèi)參基因β-ACTIN的一半,提示該樣本RHD基因型為雜合,結(jié)果見圖3和表3。

表3 數(shù)字PCR檢測RHD雜合性

圖3 數(shù)字PCR檢測RHD基因的相對(duì)表達(dá)

6 RhD抗原蛋白建模 從3D結(jié)構(gòu)模型可以看出,部分D型與野生型RhD蛋白在第3個(gè)胞外環(huán)存在螺旋構(gòu)象的改變,提示p.Asp164Glu突變影響了蛋白的螺旋結(jié)構(gòu),可能導(dǎo)致D抗原epD6.6、epD6.4、epD6.1、epD5.4和epD8.2表位的缺失,結(jié)果見圖4。

圖4 野生型及突變型RhD蛋白的3D結(jié)構(gòu)比較

討 論

RhD蛋白編碼基因RHD突變導(dǎo)致其胞外環(huán)改變是產(chǎn)生部分D表型的主要原因。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過80種部分D等位基因,大部分來自歐洲及非洲血統(tǒng)[13]。曾有研究顯示,中國人群中部分D的占比約為0.003%[14],是稀有的血型。

本研究中的樣本來自1名無償志愿獻(xiàn)血者,初篩為RhD陰性,D陰性確認(rèn)結(jié)果為D變異型。利用Sanger測序檢測發(fā)現(xiàn)其RHD基因4號(hào)外顯子存在c.492C>G突變,為錯(cuò)義突變,編碼氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替換。天冬氨酸和谷氨酸均為酸性氨基酸,但等電點(diǎn)略有差異,這種突變是否影響對(duì)應(yīng)抗原表達(dá),還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究為國內(nèi)首次上報(bào)該位點(diǎn)突變部分D表型的血清學(xué)結(jié)果。針對(duì)RHD*492G位點(diǎn)突變目前國際上僅澳大利亞研究人員報(bào)道過1例個(gè)體。LOPEZ[15]等人通過測序及抗原表位分析,2017年首次上報(bào)基因庫,登錄序列號(hào)為KY614793,但已報(bào)道的攜帶RHD*492G位點(diǎn)突變的1例部分D個(gè)體表型與本例突變樣本缺失的抗原表位不同,樣本紅細(xì)胞與針對(duì)D抗原的epD8.1、epD5.1、epD6.3、epD1.1、epD4.1、epD9.1、epD6.6和epD6.3表位的單克隆抗-D反應(yīng)呈強(qiáng)陽性4+,epD3.1、epD1.2表位的單克隆抗-D反應(yīng)呈陽性(分別為3+和2+),僅epD1.2表位單克隆抗-D反應(yīng)為陰性??乖砦蝗笔Р町惖脑蛏胁幻鞔_,但因兩例個(gè)體的人群背景不同,提示可能存在個(gè)體差異。同時(shí),已報(bào)道樣本CE分型為Ccee,而本研究為CcEe,是否有關(guān)需進(jìn)一步研究。此外,荷蘭研究人員STEGMANN等人報(bào)道過1例c.492C>A的錯(cuò)義突變(RHD*61)[12],RHD*61位點(diǎn)突變雖然也會(huì)導(dǎo)致編碼氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替代,導(dǎo)致部分D表型,但其與本例及已報(bào)道RHD*492G位點(diǎn)突變的血清學(xué)結(jié)果不同。該研究報(bào)道的抗原表位,除D抗原epD5、epD8.2表位缺失外,樣本紅細(xì)胞與針對(duì)D抗原的epD1、epD2、epD3、epD6、epD7、epD8和epD9表位的單克隆抗-D反應(yīng)均呈強(qiáng)陽性或陽性(4+或3+),與針對(duì)D抗原的多克隆抗-D反應(yīng)呈陽性(3+)。

實(shí)時(shí)定量PCR[16]和數(shù)字PCR[6]技術(shù)均可用于RHD基因型檢測,本課題組曾采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測RHD基因合子型用以補(bǔ)充RFLP方法可能產(chǎn)生的誤判[17]。數(shù)字PCR是基因表達(dá)的定量檢測技術(shù),近年發(fā)展起來用于檢測RHD基因合子型,其相對(duì)于實(shí)時(shí)定量PCR,可以更準(zhǔn)確地進(jìn)行基因分型。本研究中利用數(shù)字PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)隨機(jī)樣本的合子型進(jìn)行分析比較。RHD基因與內(nèi)參基因β-ACTIN相對(duì)定量結(jié)果顯示,數(shù)字PCR技術(shù)在靈敏度和基因分型的準(zhǔn)確性上更具優(yōu)勢。此外,組內(nèi)數(shù)據(jù)的離散程度顯示,變異系數(shù)(CV值)在數(shù)字PCR得到的結(jié)果中顯著低于實(shí)時(shí)定量PCR,說明其結(jié)果重現(xiàn)性更高、更穩(wěn)定、更精確,可以大大地降低因結(jié)果離散導(dǎo)致的誤判。通過數(shù)字PCR技術(shù),進(jìn)一步分析該個(gè)體RHD基因合子型,確認(rèn)其基因型為雜合RHD基因,提示RHD基因的1條等位基因攜帶c.492C>G突變,1條等位基因缺失。

本研究的不足之處在于,由于該例攜帶新突變的部分D個(gè)體為獻(xiàn)血者,缺乏D抗原同種免疫相關(guān)的臨床證據(jù),因此其臨床意義還需進(jìn)一步探討。同時(shí),本研究與國外報(bào)道均顯示該突變雖然導(dǎo)致D抗原表位的部分缺失,但D抗原強(qiáng)度較強(qiáng)。如采用的單克隆抗-D鑒定試劑不當(dāng),誤判為D陰性并輸注給陰性受血者,可能會(huì)產(chǎn)生同種抗體,繼而引起溶血性輸血反應(yīng)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)1例部分D表型獻(xiàn)血者其RHD等位基因?yàn)閲鴥?nèi)首次報(bào)道,并分析其D抗原表位及表型產(chǎn)生可能的分子機(jī)制。部分D個(gè)體存在抗-D同種異體免疫的高風(fēng)險(xiǎn)[18],因此,準(zhǔn)確鑒定基因型可為其輸血安全提供準(zhǔn)確的依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

猜你喜歡
單克隆表型抗原
FDA批準(zhǔn)緊急使用授權(quán)禮來新冠抗體Bebtelovimab對(duì)Omicron有效
水稻胚胎和胚乳雙缺陷突變體eed1的表型與遺傳分析
非洲豬瘟病毒P30蛋白單克隆抗體制備、鑒定及阻斷ELISA方法的建立
基于衰老相關(guān)分泌表型理論探討老年慢性阻塞性肺疾病患者衰弱發(fā)生機(jī)制
新冠病毒抗原檢測知多少
新冠抗原檢測入醫(yī)保,算的是大賬
高通量植物表型平臺(tái)綜述
作物表型組學(xué)和高通量表型技術(shù)最新進(jìn)展(2020.2.2 Plant Biotechnology Journal)
有血液學(xué)意義的單克隆免疫球蛋白血癥1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
前列腺特異抗原高就是癌嗎
通州区| 铁岭县| 重庆市| 襄汾县| 泗阳县| 太仆寺旗| 甘洛县| 密云县| 老河口市| 台州市| 凤山市| 马关县| 德州市| 沙田区| 醴陵市| 拉孜县| 堆龙德庆县| 额尔古纳市| 四会市| 南乐县| 响水县| 康平县| 承德市| 扶余县| 辽宁省| 桑日县| 花垣县| 金寨县| 赤水市| 休宁县| 龙陵县| 平和县| 南川市| 安远县| 思茅市| 盱眙县| 密山市| 辽宁省| 伊春市| 柏乡县| 衡水市|