趙俸涌 張玉宇 王中英 徐婷 李勤 張嘉敏 向東 朱自嚴(yán)

臨床輸血研究中，如何為自身免疫性溶血性貧血（自免溶貧，autoimmune hemolytic anemia，AIHA）患者進(jìn)行配血與輸血是較為困難的問題。首先，由于AIHA患者體內(nèi)存在的自身抗體會(huì)介導(dǎo)患者自身紅細(xì)胞發(fā)生免疫清除，故該類患者往往需要長(zhǎng)期接受輸血治療，這大大增加了該類患者產(chǎn)生血型同種抗體的可能性[1]；其次，血清學(xué)方法通過血凝反應(yīng)判讀結(jié)果，而自身抗體與弱的血型同種抗體在血凝結(jié)果上不易區(qū)分，導(dǎo)致較弱的同種抗體存在漏檢的可能[2]，在臨床配血中，如果患者同時(shí)具有自身抗體和血型同種抗體，在自身抗體的干擾下，配血難以識(shí)別同種抗體的存在[3]，一旦輸入與同種抗體不配合的紅細(xì)胞，將激活免疫系統(tǒng)，使患者的溶血加重，病情惡化[4]。自身抗體對(duì)同種抗體的掩蓋作用，主要由兩方面的因素造成：首先，同種抗體親和力較高，更多被輸入的不配合紅細(xì)胞消耗，增加了同種抗體的檢測(cè)難度[5]。其次，在自身免疫性疾病研究中發(fā)現(xiàn)，自身抗體通常親和力較同種異體抗體弱[6]，如果此現(xiàn)象亦存在于自免溶貧，則在輸入不配合紅細(xì)胞后，單位時(shí)間內(nèi)，自身抗體消耗遠(yuǎn)小于同種抗體，而在血清學(xué)方法中，相對(duì)比例提高的自身抗體就會(huì)進(jìn)一步增加同種抗體檢測(cè)的難度。

為應(yīng)對(duì)上述問題，目前一些臨床輸血檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常采用稀釋抗體及吸收自身抗體的方法進(jìn)行同種抗體鑒定，以增加自免溶貧患者樣本中同種抗體的檢出率，但前者常存在因稀釋作用而導(dǎo)致同種抗體的漏檢；后者中，自體細(xì)胞吸收方法因受血者體內(nèi)有近期輸入的異體紅細(xì)胞，而存在同種抗體被吸附的風(fēng)險(xiǎn)，而采用異體細(xì)胞吸收也存在吸附自身抗體同時(shí)吸附同種抗體。此前，本實(shí)驗(yàn)室已應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)高敏感度的優(yōu)勢(shì)，對(duì)血型抗原的個(gè)體差異及穩(wěn)定性進(jìn)行了相關(guān)研究并取得了較為良好的檢測(cè)結(jié)果[7]，在此基礎(chǔ)上，擬利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)模擬自身抗體掩蓋同種抗體的樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)血清學(xué)方法進(jìn)行比較。

材料與方法

1 試驗(yàn)材料 本研究涉及所有樣本均經(jīng)過倫理告知，符合醫(yī)學(xué)倫理。樣本均來源于上海市血液中心。

O型紅細(xì)胞樣本（ccDEE，3例；ccdee，3例），效價(jià)為64的無特異性人源性自身抗體1例、人源性IgG-D 5例（效價(jià)分別為4 096、512、128、256、256），人源性IgG-E 4例（效價(jià)分別為128、512、256、256），多人份抗篩陰性新鮮混合AB血漿。

2 試劑與儀器 抗人IgG Fab'熒光二抗Alexa Fluor 647（Jackson，144879），0.3% BSA的PBS（上海源培，G40608），cytoflex流式細(xì)胞儀（Beckman，A001-1-1102），伯樂抗人球凝膠卡（Bio-rad，50631.60.17），離心機(jī)（久保田，KA-2200），微柱凝膠卡用離心機(jī)（久保田，5500）。

3 方法

3.1 AIHA模擬血漿樣本的設(shè)立：將1例人源性IgG-D、1例人源IgG-E抗血漿分別使用多人份AB血漿，均稀釋標(biāo)定至與自身抗體相同的效價(jià)。同種抗體按表1比例倍比稀釋后與自身抗體等量混合，制備64效價(jià)組自身抗體+混合同種抗體的模擬自免溶貧患者血漿及對(duì)照血漿（“64效價(jià)組”指同種抗體和自身抗體效價(jià)均為64效價(jià)）?！?2效價(jià)組”、“16效價(jià)組”由“64效價(jià)組”倍比稀釋制備。

表1 64效價(jià)模擬血漿制備方法（200 μL體系）

3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法：收集新鮮的ccDEE和ccdee的血樣，加入含0.3% BSA的PBS，1 000 g，3 min離心洗滌3次，用生理鹽水配制3%紅細(xì)胞懸液。取10 μL紅細(xì)胞懸液，加入等量的模擬AIHA患者血漿充分混勻，37 ℃致敏30 min；洗滌后每管加入熒光二抗50 μL（抗人IgG Fab'熒光二抗Alexa Fluor 647，按照說明書溶解后，1∶50稀釋應(yīng)用），室溫孵育25 min ；洗滌，1 mL PBS重懸，進(jìn)行流式檢測(cè)。記錄單個(gè)紅細(xì)胞（流式圈門邏輯中的P3門內(nèi)細(xì)胞）的平均熒光強(qiáng)度（MFI值）。

3.3 凝膠卡法：伯樂抗人球凝膠卡中，20 μL 3 %紅細(xì)胞懸液，加20 μL模擬血漿，37℃孵育15 min，離心，觀察凝集強(qiáng)度并評(píng)分記錄，凝膠卡法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為本室參考標(biāo)準(zhǔn)，見圖1。

圖1 微柱凝膠卡檢測(cè)評(píng)分表

3.4 驗(yàn)證流式檢測(cè)AIHA模擬血漿效果穩(wěn)定性：選取流式方法檢出下限對(duì)應(yīng)的AIHA模擬血漿組（使用-D和-E作為同種抗體組分，效價(jià)為64、32、16），采用3.1中方法，另使用不同的人源性抗-D（4例）與抗-E（3例）同種抗體，配制模擬血漿；再分別按照方法3.2、3.3進(jìn)行檢測(cè)。

4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖 本研究使用IBM SPSS 22.0對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。在流式檢測(cè)模擬AIHA血漿實(shí)驗(yàn)中，對(duì)模擬血漿與對(duì)應(yīng)抗原陽性、陰性細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析（見結(jié)果1），對(duì)抗原陰性細(xì)胞與模擬血漿的檢測(cè)結(jié)果，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行核驗(yàn)以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性（見結(jié)果1）；流式方法和凝膠卡法比較實(shí)驗(yàn)中，兩種方法間比較結(jié)果采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析（見結(jié)果3）。

結(jié) 果

1 流式檢測(cè)模擬AIHA血漿結(jié)果 64效價(jià)組中，各組自身抗體與不同稀釋度的同種抗體（抗D或抗E）混合，制備模擬AIHA血漿，并使其與相應(yīng)抗原陽性的紅細(xì)胞反應(yīng)。當(dāng)同種抗體占同效價(jià)自身抗體1/2～1/16時(shí)，結(jié)果（MFI）均與陰性對(duì)照（僅自身抗體）存在明顯差異，配對(duì)t檢驗(yàn)P＜0.05，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而平行抗原陰性細(xì)胞對(duì)照實(shí)驗(yàn)，MFI值為1 238±189（n=7），獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P＞0.05，即抗原陰性細(xì)胞反應(yīng)不受加入的同種抗體影響。

以上結(jié)果顯示，在“64效價(jià)組”中，流式方法最低檢測(cè)限為占自身抗體1/16（同效價(jià)體積比）的混合同種抗體。

按同樣方法，檢出并驗(yàn)證了“32效價(jià)組”和“16效價(jià)組”中，流式方法可檢出對(duì)僅占自身抗體1/8（同效價(jià)體積比）混合比例的模擬AIHA血漿中的同種抗體。并且兩個(gè)效價(jià)組中，抗原陰性細(xì)胞反應(yīng)不受加入的同種抗體影響。

綜上，流式方法對(duì)自身抗體掩蓋下的同種抗體最低檢測(cè)限（可檢出同種抗體的最大自身抗體∶同種抗體稀釋比）為：64效價(jià)組：16∶1稀釋；32效價(jià)組：8∶1稀釋；16效價(jià)組：8∶1稀釋。

流式檢測(cè)結(jié)果示意見圖2 DE。

圖2 流式檢測(cè)圖（32效價(jià)組模擬血漿（抗-D同種抗體））

2 血清學(xué)方法檢測(cè)模擬AIHA血漿結(jié)果 64效價(jià)組中，傳統(tǒng)血清學(xué)方法在自身抗體：同種抗體為1∶1～4∶1時(shí)，可檢出同種抗體的存在，檢測(cè)下限為4∶1；在32效價(jià)組和16效價(jià)組中，傳統(tǒng)血清學(xué)方法同樣檢出下限均為2∶1。檢測(cè)結(jié)果示意見圖3。

圖3 Bio-rad抗人球凝膠卡檢測(cè)模擬AIHA患者血漿結(jié)果示意圖

3 比較流式方法和凝膠卡法 經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，各效價(jià)組中，流式方法檢出下限均為微柱凝膠卡法的4倍（P≤0.05）（見圖4A-C）。流式方法檢出自身抗體掩蓋下的同種抗體敏感度更高。

為驗(yàn)證流式方法檢出下限穩(wěn)定性，又經(jīng)過材料與方法3中使用不同的人源性抗-D（4例）與抗-E（3例）同種抗體配制共7份模擬血漿進(jìn)行驗(yàn)證，3個(gè)效價(jià)組中仍均能在前述最低檢出限中（64效價(jià)同種抗體：自身抗體，16∶1；32效價(jià)/16效價(jià)，8∶1）檢出同種抗體（P≤0.05）（見圖4D）。流式方法檢出自身抗體掩蓋下的同種抗體檢測(cè)效果具有高敏感度和穩(wěn)定性。

圖4 流式方法與抗人球凝膠卡法檢測(cè)敏感度比較

討 論

自身抗體是機(jī)體針對(duì)自身組織，器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體[8]。正常人體內(nèi)低效價(jià)的自身抗體參與了衰老細(xì)胞清除等機(jī)制，當(dāng)機(jī)體自身抗體的效價(jià)超過閾值，就可能對(duì)自體器官組織進(jìn)行攻擊，造成損傷，誘發(fā)疾病。高效價(jià)自身抗體多發(fā)于免疫功能紊亂、移植及腫瘤患者[9]。雖然對(duì)自免溶貧患者自身抗體的產(chǎn)生機(jī)理尚未徹底闡明，但有研究表明，自身抗體與B細(xì)胞的突變有關(guān)，突變的B細(xì)胞產(chǎn)生了異常糖基化，這些異常糖基化的抗體可識(shí)別自身抗原[10]。

在輸血領(lǐng)域中自身抗體對(duì)于患者血液輸注帶來了極大挑戰(zhàn)，一方面，自身抗體通常會(huì)導(dǎo)致自身紅細(xì)胞被病理性清除，導(dǎo)致血紅蛋白降低，極大威脅患者健康及生活質(zhì)量[11-12]；另一方面，此類病患對(duì)于貧血的緩解高度依賴紅細(xì)胞輸注治療，而病患的自身抗體會(huì)造成直抗和間抗陽性，導(dǎo)致配血不合；自身抗體還會(huì)導(dǎo)致在抗體篩查及鑒定過程中對(duì)同種抗體的掩蓋，導(dǎo)致同種血型抗體的漏檢幾率大大增加[13-14]。

目前實(shí)驗(yàn)室通常采用的傳統(tǒng)血清學(xué)方法對(duì)此類患者樣本進(jìn)行抗體鑒定與配血，其中交叉配血實(shí)驗(yàn)是保障輸血安全的最后關(guān)卡，在臨床配血實(shí)驗(yàn)中凝膠卡方法是敏感度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性最高的方法之一。在血清學(xué)方法檢測(cè)過程中，由于自身抗體與同種抗體均產(chǎn)生凝集，因此必然會(huì)發(fā)生相互干擾的現(xiàn)象。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，自身抗體與同種抗體均以熒光量作為標(biāo)記，單純自身抗體與不同紅細(xì)胞結(jié)合能力幾乎相同，產(chǎn)生免疫熒光相近，但在自身抗體混合同種抗體的情況下，存在的同種抗體將與對(duì)應(yīng)抗原陽性細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生免疫熒光的疊加，最終導(dǎo)致免疫熒光值高于抗原陰性細(xì)胞，故可更有效地對(duì)混于自身抗體中的同種抗體進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，在同種抗體被自身抗體掩蓋、難以判斷抗體特異性的情況下，流式方法能在一定程度上消除同種抗體掩蓋效應(yīng)的影響。從而對(duì)配血實(shí)驗(yàn)中，患者血漿中是否存在于擬輸入紅細(xì)胞樣本抗原發(fā)生免疫的血型同種抗體進(jìn)行檢測(cè)。確保交叉配血試驗(yàn)中主側(cè)配血結(jié)果可靠。

雖然本研究通過多例自身、同種抗體混合體系進(jìn)行了檢測(cè)方法的比較，并獲得了較好的結(jié)果，為臨床應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)；但本研究還存在以下一些問題與不足，首先，本研究?jī)H對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了驗(yàn)證，在臨床研究中，對(duì)于陰陽性判斷的臨界值還需要大量臨床樣本實(shí)驗(yàn)總結(jié)，這也是未來本研究團(tuán)隊(duì)擬進(jìn)行的研究方向；其次，對(duì)于一些具有半衰期較短的血型系統(tǒng)抗體（如Kidd系統(tǒng)血型同種抗體）[15-16]，其血清中抗體含量極低，流式方法對(duì)此類抗體的檢測(cè)能力，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。此外，本研究涉及的流式體系從理論上還可應(yīng)用于藥物抗體掩蓋的同種抗體檢測(cè)、藥物誘導(dǎo)的具有血型特異性的自身抗體的檢測(cè)，具體效果還有待在未來進(jìn)一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突