向東 范亮峰 劉曦 沈偉 鄭皆煒 謝軍華 王中英 金沙 陸瓊 姜躍勤 張玉宇

免疫性溶血性輸血反應(yīng)（IHTRs）是指患者的血型免疫抗體與輸入紅細(xì)胞反應(yīng)，并破壞了輸注紅細(xì)胞（RBCs）的一種輸血不良反應(yīng)。IHTR主要包括急性溶血性輸血反應(yīng)（AHTR）和遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)（DHTR），大部分的溶血反應(yīng)屬于后者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，IHTR的發(fā)生率可能遠(yuǎn)高于當(dāng)前檢出率：一般認(rèn)為嚴(yán)重DHTR的發(fā)生率在1/2 300～1/6 715[1-3]，然而有專家指出，實(shí)際發(fā)現(xiàn)的溶血性輸血反應(yīng)可能僅占實(shí)際發(fā)生的1/3[4]。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，特別是檢測(cè)靈敏度提高，溶血性輸血反應(yīng)的檢出率明顯增加[5]。本實(shí)驗(yàn)室自2010年以來，通過毛細(xì)管離心技術(shù)、PEG增強(qiáng)技術(shù)，微柱凝集卡等技術(shù)的普遍使用，以及對(duì)IHTR實(shí)驗(yàn)室鑒別的重點(diǎn)關(guān)注，溶血性輸血反應(yīng)檢出率不斷增加。鑒于近十年來，臨床輸血治療及總輸血量并沒有明顯變化，從一個(gè)側(cè)面反映了以往IHTR的大量漏檢。本項(xiàng)回顧性研究旨在分析臨床免疫性溶血性輸血反應(yīng)的特點(diǎn)，分析造成臨床漏檢的可能原因，以及實(shí)驗(yàn)室及時(shí)發(fā)現(xiàn)IHTR的檢測(cè)技術(shù)關(guān)鍵，為相關(guān)研究提供借鑒。

材料與方法

1 一般材料 本研究樣本均來自2011年3月～2021年3月，上海市及上海周邊城市醫(yī)院送檢的患者樣本，其中排除了自身免疫性溶血性貧血、藥物抗體及新生兒患者。所有樣本均由上海市血液中心血型參比實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2 方法 溶血性輸血反應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)為：（1）患者有近期（通常為3個(gè)月內(nèi)）輸血史；（2）患者血樣中檢出同種抗體且未檢出自身抗體；（3）患者血樣中檢出與血樣中抗體反應(yīng)的紅細(xì)胞。患者的輸血史大多來自于檢測(cè)申請(qǐng)單上醫(yī)生填寫的信息，少數(shù)來自向醫(yī)生問詢或查閱病案資料。所有患者血樣的不規(guī)則抗體鑒定，除應(yīng)用試管鹽水法之外，可能單獨(dú)或聯(lián)合使用下列幾種非鹽水介質(zhì)方法，包括：試管抗人球蛋白法、手工微柱凝集法、聚凝胺法（上海血液生物聚凝胺試劑）等。在對(duì)抗體反應(yīng)較弱的樣本檢測(cè)中，聚乙二醇（PEG）增強(qiáng)方法被普遍應(yīng)用于試管抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)及微柱凝集實(shí)驗(yàn)。20%聚乙二醇溶液使用LIM（上海血液生物公司聚凝胺試劑盒配套試劑）配制，兩份血清、一份2%～3%紅細(xì)胞懸液和4份聚乙二醇溶液在37℃孵育15 min，生理鹽水三洗，加抗人球蛋白試劑（增強(qiáng)抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)），或各試管加入1滴鹽水混勻，各吸取50 μL加入抗人球蛋白卡中離心（增強(qiáng)的微柱凝集卡實(shí)驗(yàn)）。聚乙二醇增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)也被用于抗體篩查和交叉配血實(shí)驗(yàn)中以增加檢測(cè)靈敏度。在確定患者是否存在與樣本中同種抗體反應(yīng)的紅細(xì)胞時(shí)，如有可能，則直接檢測(cè)患者血樣，或檢測(cè)患者輸入紅細(xì)胞的留樣中相應(yīng)抗原。如果無法直接檢測(cè)，則應(yīng)用毛細(xì)管離心法，檢測(cè)“遠(yuǎn)心端”的紅細(xì)胞血型。由于“遠(yuǎn)心端”通常富集了輸入的紅細(xì)胞，可提高輸入的“不配合型”紅細(xì)胞檢出率；少數(shù)樣本通過患者紅細(xì)胞放散實(shí)驗(yàn)，檢出與患者血清或血漿中相同特異性的同種抗體，也用于判定血樣中存在不配合的紅細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)也被用于檢出含不配合抗原的紅細(xì)胞。

3 試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)中直抗均使用多特異性和單特異性抗IgG、單特異性抗C3試劑同時(shí)檢測(cè)，直抗試劑均來自上海血液生物公司。定型試劑、抗人球蛋白試劑、酸放散試劑均為上海血液生物公司產(chǎn)品。毛細(xì)管離心機(jī)（BASO），微柱凝集卡（伯樂，奧森多及其配套設(shè)備），試管離心機(jī)為KA2200型（日本久保田），抗體鑒定細(xì)胞為Immucor公司，Sanquin公司，Reagent公司和上海血液生物公司產(chǎn)品。

結(jié) 果

隨機(jī)選取2011年3月～2021年3月符合IHTR標(biāo)準(zhǔn)的100個(gè)案例進(jìn)行研究。統(tǒng)計(jì)分析包括抗體特異性分布，血紅蛋白水平分布，診斷，IHTR檢出與末次輸血的間隔時(shí)間，檢出時(shí)造成IHTR抗體的效價(jià)及直抗強(qiáng)度等數(shù)據(jù)，詳見圖1。

圖1 100例溶血性輸血反應(yīng)案例特點(diǎn)

討 論

IHTR包括AHTR和DHTR。AHTR在輸血后24 h內(nèi)發(fā)生溶血反應(yīng)，而DHTR超過24 h發(fā)生溶血反應(yīng)。由ABO血型不配合輸注造成的輸血反應(yīng)，通常為典型的AHTR，表現(xiàn)為血管內(nèi)溶血；而Rh血型抗體造成的溶血性輸血反應(yīng)通常為典型的DHTR，表現(xiàn)為血管外溶血。然而在臨床檢測(cè)實(shí)踐中，兩者很難截然分開，由Rh抗體引起的溶血反應(yīng)，也常常在24 h內(nèi)顯現(xiàn)溶血反應(yīng)癥狀。本系列案例中唯一1例由ABO系統(tǒng)抗體（抗A）造成的溶血性輸血反應(yīng)，是由白血病引起ABO血型變化，導(dǎo)致的ABO不配合輸血，在輸血19天后才被發(fā)現(xiàn)。而輸血后1天左右發(fā)現(xiàn)的19例輸血反應(yīng)，大多由于存在明顯輸血不良反應(yīng)而由醫(yī)院送至本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，所涉及的抗體大多是Rh系統(tǒng)抗體（12例），其他包括Kidd系統(tǒng)抗體4例，其中3例與Rh抗體共存；抗Dia 2例，1例和Rh抗體共存、1例和Kidd抗體共存；另外還有4例抗-M，1例與Rh抗體共存，其余單獨(dú)存在。

本文統(tǒng)計(jì)的大多數(shù)案例屬于一般意義上的遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)，根據(jù)部分有輸血前后血紅蛋白數(shù)據(jù)的案例顯示，此類反應(yīng)可讓受血者的血紅蛋白下降10～30 g/L左右，若計(jì)算輸入紅細(xì)胞及患者在貧血情況下的應(yīng)激造血，估計(jì)每位患者溶血量可達(dá)1 000～2 000 mL，部分案例見表1。

表1 部分患者發(fā)生IHTR前后的血紅蛋白下降

目前Rh系統(tǒng)抗體仍是溶血性輸血反應(yīng)中最為常見的抗體，在本系列統(tǒng)計(jì)中占78%，Kidd抗體占11%（見圖1A）；據(jù)英國(guó)SHOT統(tǒng)計(jì)[6]，2013～2017年明確特異性抗體造成的溶血性輸血反應(yīng)共83例中，Kidd系統(tǒng)抗體占60%，Rh系統(tǒng)抗體僅占20%（ANNUAL SHOT REPORT 2017）。Kidd系統(tǒng)抗體產(chǎn)生后容易消失，造成再次輸血反應(yīng)的漏檢[7]。而Rh抗體相對(duì)穩(wěn)定，不易被漏檢。有報(bào)道，隨著檢測(cè)技術(shù)的提高，Kidd系統(tǒng)抗體引起的溶血性輸血反應(yīng)檢出率大幅度提高[8-10]。本研究中Rh系統(tǒng)抗體造成的IHTR遠(yuǎn)高于Kidd系統(tǒng)抗體，反映了國(guó)內(nèi)臨床輸血檢測(cè)技術(shù)仍有較大提升空間。

毛細(xì)管法通過較強(qiáng)離心力作用，可相對(duì)分離輸入紅細(xì)胞和患者自身紅細(xì)胞，此方法通常在遠(yuǎn)心端富集輸入紅細(xì)胞（較重）；在近心端富集自身紅細(xì)胞（較輕）。本文100個(gè)案例中，共有67例應(yīng)用了毛細(xì)管分離實(shí)驗(yàn)，其中51例（76%）效果很好，遠(yuǎn)心端檢出參與溶血反應(yīng)的輸入紅細(xì)胞，并且近、遠(yuǎn)心端抗原、直抗差異明顯。7例近遠(yuǎn)心端僅存在抗-IgG強(qiáng)弱差別，其中1例僅通過毛細(xì)管法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢出遠(yuǎn)心端直抗陽性（輸血后180天）；6例近、遠(yuǎn)心端無差異，3例近、遠(yuǎn)心端結(jié)果和預(yù)計(jì)相反。分析9例毛細(xì)管法失效的原因，1例末次輸血已過60天，且造成溶血的抗-E效價(jià)達(dá)5 120，可能輸入不相合的紅細(xì)胞已經(jīng)完全被破壞，無法通過毛細(xì)管法檢出。其它8例從性別、診斷、抗體特異性、輸血后時(shí)間等角度，均未發(fā)現(xiàn)明顯規(guī)律。總之，毛細(xì)管法是研究溶血性輸血反應(yīng)的有力工具，可輔助確認(rèn)IHTR的發(fā)生，然而也有一定的失敗比例，其原因仍需進(jìn)一步探討。

從輸血到檢出IHTR的間隔時(shí)間，也在一定程度上反映了臨床對(duì)溶血性輸血反應(yīng)癥狀的監(jiān)控，以及實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力。OKUTSU等發(fā)現(xiàn)，使用PEG增強(qiáng)的抗人球蛋白技術(shù)，與未增強(qiáng)的抗人球蛋白技術(shù)比較，溶血性輸血反應(yīng)的檢出時(shí)間（從輸血至檢出溶血反應(yīng)的時(shí)間）從平均23.5天減少到15.7天[8]。本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)弱抗體時(shí)常規(guī)使用PEG試劑，IHTR平均檢出時(shí)間是18.7天（圖1D）。

值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生IHTR的案例中，造成輸血反應(yīng)的抗體效價(jià)普遍較低（見圖1E），抗體效價(jià)≤4的弱抗體占80%，這一現(xiàn)象可能由輸入的不配合紅細(xì)胞大量吸附抗體并被快速清除導(dǎo)致。這意味著在輸血反應(yīng)發(fā)生后，抗體不易被檢出，從而可能致使再次輸入不配合紅細(xì)胞，誘發(fā)免疫記憶反應(yīng)，促使大量血型同種抗體生成，引起更為嚴(yán)重的后果[11-13]。

IHTR發(fā)生后直抗可在較長(zhǎng)時(shí)間維持陽性（見圖1F）。直抗大約在輸血后2周左右達(dá)到峰值，而在8周后仍能被檢出。IHTR患者的直抗普遍較弱，峰值時(shí)，平均直抗強(qiáng)度僅為1+左右，而8周后直抗強(qiáng)度均值更降至“±”左右，因此提高直抗檢測(cè)的敏感度，對(duì)發(fā)現(xiàn)IHTR十分重要。

分析發(fā)現(xiàn)，IHTR的發(fā)生大多與近期反復(fù)輸血有關(guān)。對(duì)所有100例輸血反應(yīng)患者輸血史進(jìn)行調(diào)查，可確認(rèn)的輸血次數(shù)為5.8±7.9（，1～50）。將輸血反應(yīng)和同期檢出同種抗體（非溶血性輸血反應(yīng)）的患者進(jìn)行比較，其性別、年齡分布存在明顯差異（見圖2）。檢出血型同種抗體的非IHTR患者中，女性在20～69歲年齡段，檢出抗體的數(shù)量為同齡男性的數(shù)倍。女性體內(nèi)異常增高的抗體分布顯然來自妊娠免疫，并持續(xù)至60歲仍明顯多于男性。如果輸血反應(yīng)僅僅因?yàn)檩斎氩慌浜霞t細(xì)胞而產(chǎn)生，則20～69歲女性產(chǎn)生輸血反應(yīng)的幾率應(yīng)該明顯高于男性。然而統(tǒng)計(jì)結(jié)果未見這一趨勢(shì)。對(duì)這一現(xiàn)象的合理解釋是，實(shí)驗(yàn)室檢出的IHTR大多數(shù)為嚴(yán)重的溶血性輸血反應(yīng)，而嚴(yán)重IHTR的發(fā)生，有賴于多次輸血，特別是短時(shí)間反復(fù)輸血。在本研究系列中，臨床反復(fù)輸血的患者，男、女性別之間的差異不明顯。妊娠免疫所產(chǎn)生的抗體，從出現(xiàn)至不配合輸血，相隔時(shí)間可能較長(zhǎng)，免疫系統(tǒng)處于未激活狀態(tài)，相應(yīng)的免疫性溶血反應(yīng)也相對(duì)溫和。而近期反復(fù)輸注不配合血液，導(dǎo)致免疫回憶反應(yīng)，在免疫系統(tǒng)激活的狀態(tài)下再次輸入不配合血液，可造成較嚴(yán)重的溶血反應(yīng)。本研究設(shè)計(jì)中，IHTR案例的入選標(biāo)準(zhǔn)沒有考慮臨床指標(biāo)，主要由于臨床送檢的患者標(biāo)本大多缺少輸血前后的臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)。在臨床醫(yī)院對(duì)IHTR的研究中，包含患者輸血后血紅蛋白的下降數(shù)據(jù)更為合理。在VAMVAKAS等報(bào)道中，將患者輸血后Hb下降≥10 g/L作為實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)之外的臨床指標(biāo)[10]。

圖2 IHTR患者與檢出同種抗體患者的年齡分布

圍繞輸血進(jìn)行的檢測(cè)，主要目的為避免血型免疫造成溶血性輸血反應(yīng)。然而血型抗體造成溶血反應(yīng)的數(shù)量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出預(yù)測(cè)。臨床由血型抗體造成溶血性輸血反應(yīng)的真實(shí)比例可能達(dá)到1/1 500次輸血[10]。如何減少這些反應(yīng)的發(fā)生，是輸血工作者應(yīng)該高度重視的問題。目前國(guó)內(nèi)公開發(fā)表的臨床輸血反應(yīng)案例比較少，這不利于輸血工作者對(duì)IHTR的了解和研究，不利于臨床對(duì)IHTR患者的及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，不利于輸血檢測(cè)人員對(duì)關(guān)鍵技術(shù)的把控。本文通過回顧性研究，對(duì)免疫性溶血性輸血反應(yīng)案例的特點(diǎn)進(jìn)行分析總結(jié)，希望能為臨床輸血工作者提供有價(jià)值的參考信息。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突