劉勤　王璐　張紅宇

【摘 要】 目的：對市場上流通的醒腦靜注射液在溶血性方面進(jìn)行考察研究。方法：參考《中國藥典》2015年版四部生物檢查法及注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則和中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術(shù)指導(dǎo)原則，對市售所有廠家的34批醒腦靜注射液分別制備成3個濃度進(jìn)行溶血試驗(yàn)研究，并采用肉眼觀察法和分光光度法判定溶血結(jié)果，比較兩種方法的差異性。結(jié)果：相同廠家不同批次、不同廠家間醒腦靜注射液的溶血率存在差異，另外，在溶血率為5%～15%時(shí)，肉眼觀察法存在漏判現(xiàn)象。結(jié)論：在臨床使用和實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測中應(yīng)該高度重視醒腦靜注射液溶血的不良反應(yīng)，建議在其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中增加“溶血與凝聚”安全性檢查項(xiàng)目，并采用分光光度法測定溶血率。

【關(guān)鍵詞】 醒腦靜注射液;溶血性;肉眼觀察法;分光光度法

【中圖分類號】R965.3 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）14-0013-04

醒腦靜注射液是一種常用的復(fù)方中藥急救制劑，是由傳統(tǒng)名方“安宮牛黃丸”改制而成的新型水溶性中藥注射液，具有清熱解毒，涼血活血，開竅醒腦的作用，靜脈注射后可通過血腦屏障直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]。隨著中藥注射劑在臨床應(yīng)用愈來愈廣泛，出現(xiàn)了諸多不良反應(yīng)事件，使中藥注射劑的安全有效性和全面質(zhì)量控制引起了社會的廣泛關(guān)注[2]，醒腦靜注射液作為急癥用藥不良反應(yīng)也是屢見不鮮[3]。溶血與凝聚作為評價(jià)注射劑安全性的重要指標(biāo)之一，在醒腦靜注射液現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收載 [4]。對于注射劑溶血項(xiàng)目的檢測，《中國藥典》 2015 年版規(guī)定采用肉眼觀察法對注射劑的溶血進(jìn)行檢測和判定[5]，此方法簡便、易行，適于溶血明顯的樣品，但對于溶血不明顯或肉眼無法判定的情況，檢驗(yàn)人員的主觀誤差影響較大。為了更加準(zhǔn)確的判斷結(jié)果，需要尋找一種更有效、 簡便的方法。根據(jù)《藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》 [6]以及文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]，對于注射劑溶血的檢測，有紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法、 紫外分光光度法、 體內(nèi)溶血試驗(yàn)法以及乳酸脫氫酶活性測定法。結(jié)合注射劑生產(chǎn)企業(yè)實(shí)驗(yàn)室的情況和判斷的準(zhǔn)確性，筆者采用肉眼觀察法和紫外分光光度法對醒腦靜注射液的溶血與凝聚進(jìn)行系統(tǒng)性考察。

1 材料與儀器

1.1 材料 34批醒腦靜注射液，A藥業(yè)15批，B藥業(yè)4批，C藥業(yè)15批;規(guī)格：5mL、2mL、10mL;氯化鈉注射液批號：C181219A，昆明南疆制藥有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動物 家兔，體重2.5～3.0kg。

1.3 儀器 TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司; UV-2550PC分光光度計(jì)，日本島津;Grant SUB28恒溫水浴，Grant Instruments （Cambridge）Ltd; ZH-2型旋渦混合器，天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 紅細(xì)胞懸液的制備 每次取兔心臟血約10mL，置含玻璃珠的燒杯中振搖約10min，除去纖維蛋白原使成脫纖血液，加入約10倍量氯化鈉注射液，搖勻，1500r·min-1離心15min，棄上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用氯化鈉注射液同上法洗滌3次，上清液不顯紅色。取沉淀紅細(xì)胞4mL用氯化鈉注射液稀釋至200mL，配成2%的紅細(xì)胞懸液供試驗(yàn)用，用時(shí)搖勻。

2.2 供試液的制備 根據(jù)“注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”中對“溶血與凝聚檢查法中設(shè)定限值”的規(guī)定，應(yīng)以無溶血和凝聚的最大濃度的1/2作為限制濃度，如果注射劑原液無溶血和凝聚反應(yīng)則以原液濃度為限值。本試驗(yàn)分別以醒腦靜注射液原液、氯化鈉注射液稀釋的2倍、5倍稀釋液為供試液，研究醒腦靜注射液的溶血性。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 肉眼觀察法 每1批樣品取潔凈試管3支編號，1、2號管為相應(yīng)的供試液管，3號管為供試品對照管，另取2支試管編號為4號管和5號管，分別為陰性對照管、陽性對照管。按表1所示依次加入2%紅細(xì)胞懸液、氯化鈉注射液、蒸餾水及供試品，立即混勻，置（37±0.5）℃恒溫水浴中保溫，3h后觀察溶血和凝聚反應(yīng)。按表2標(biāo)準(zhǔn)肉眼判斷有無溶血與凝聚現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.3.2 按2.3.1項(xiàng)下方法 進(jìn)行處理樣品后，各管1500r·min-1離心15min，取上清液，置紫外分光光度儀中，在200～800nm波長間掃描，結(jié)果顯示在545nm波長處有最大吸收。以氯化鈉注射液為陰性對照，蒸餾水為陽性對照，測定各管的OD值，按公式[溶血率（%）=（供試品管OD值-陰性對照管OD值）/（陽性對照管OD值-陰性對照管OD值）×100%]計(jì)算溶血率，以溶血率>5%表示有溶血發(fā)生。

3 試驗(yàn)結(jié)果

分別以3個廠家的原液、2倍稀釋液、5倍稀釋液為檢查濃度，進(jìn)行溶血與凝聚檢測，用肉眼觀察和紫外分光光度的方法觀察判斷樣品溶血與凝聚現(xiàn)象。

溶血率表示溶血發(fā)生的程度，大于5%即表示溶血發(fā)生。從表3、表4和表5可以看出，34批樣品用分光光度法判斷溶血，原液均引起溶血，C藥業(yè)的溶血率為80%～100%，A藥業(yè)及藥業(yè)的溶血率為40%～80%。樣品在2倍稀釋液時(shí)，其中20批有溶血現(xiàn)象發(fā)生，樣品在5倍稀釋液時(shí)，所有樣品都未有溶血現(xiàn)象發(fā)生。將34批樣品的肉眼觀察法和紫外分光光度法的溶血結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果見表6。

從表6 可以看出，34批樣品以原液和5倍稀釋液為檢查濃度時(shí)，肉眼觀察和紫外分光光度法判斷的結(jié)果是一致的，都沒有溶血現(xiàn)象發(fā)生。以2倍稀釋液為檢查濃度時(shí)，肉眼判斷有14批發(fā)生溶血，分光光度法判斷有20批發(fā)生溶血，兩者判斷有差異的6批樣品的紫外分光光度測定的溶血率大致在5%～15%之間，肉眼觀察很難發(fā)現(xiàn)。

4 討論

本法是將一定量供試液與2%兔紅細(xì)胞混懸液混合，溫育一定時(shí)間后，觀察其對紅細(xì)胞的溶血與凝聚反應(yīng)以判定供試品是否符合規(guī)定。供試品不合格表明注射劑中污染超過正常存在的溶血性物質(zhì)，或污染致血細(xì)胞凝聚，臨床用藥后將可能產(chǎn)生有關(guān)不良反應(yīng)。溶血與凝聚作為評價(jià)注射劑安全性的重要指標(biāo)之一，在醒腦靜現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未收載，因此建議應(yīng)對醒腦靜注射液的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高，并增加溶血與凝聚檢查項(xiàng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同廠家、不同批次以及不同廠家間的醒腦靜注射液在溶血性方面存在較大的差異。對于相同廠家的醒腦靜注射液，生產(chǎn)工藝相對穩(wěn)定，差異可能來自原輔料來源的穩(wěn)定性，原料藥及輔料來源不同其中所含各組分的比例及雜質(zhì)成分都可能有差異，中藥材的產(chǎn)地、采收期不同也會對中藥注射劑的質(zhì)量不穩(wěn)定性產(chǎn)生很大影響。對于不同廠家的醒腦靜注射液，受生產(chǎn)工藝和原輔料的來源不同等多重因素影響[9]，造成差異進(jìn)一步加大。醒腦靜注射液的主要成分為麝香、郁金、冰片、梔子，輔料為聚山梨酯80和氯化鈉。據(jù)了解，C廠家在生產(chǎn)該品種時(shí)使用了天然麝香和天然冰片，而A、B廠家使用的是人工麝香和人工冰片，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同廠家、不同濃度的麝香[10]和冰片[11]溶血作用有明顯差異，人工的和麝香、冰片之間的溶血性差別有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。醒腦靜注射液的輔料聚山梨酯80中的山梨醇、山梨醇酐和異山梨醇酐3種成分也均具有溶血性[12-13]。

同時(shí)，筆者從試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2倍稀釋液檢查溶血時(shí)，肉眼判斷有14批溶血，而分光光度法則判斷有20批溶血，其中6批分光光度法判為溶血的溶血率為5%～15%，肉眼觀察沒有發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用2倍稀釋液作為限值時(shí)，若有目測法會引起漏判。而紅細(xì)胞破裂釋放出來的血紅素在可見光波長段具有最大吸收，采用分光光度法測定中藥注射劑的溶血程度，具有準(zhǔn)確、操作簡便，穩(wěn)定性好，能消除常規(guī)試管法帶來的主觀誤差等缺點(diǎn)，故判斷結(jié)果時(shí)建議采用分光光度法。

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（收稿日期：2019-06-16 編輯：陶希睿）