曹寶國(guó) 劉惠娟 王新舜 王 恒 馬 琳 樊紅波

1.甘肅省天水市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，甘肅天水 741000；2.甘肅省天水市中醫(yī)醫(yī)院臨床藥學(xué)研究室，甘肅天水 741000；3.甘肅省天水市中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，甘肅天水 741000

冠心病即冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，是心臟冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化引起官腔狹窄或閉塞而導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死的心臟病，可嚴(yán)重危害人體健康，近年來(lái)，冠心病的發(fā)病率隨著人們生活水平的提高而逐漸上升[1-2]。竭香定痛膠囊是天水市中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的中藥制劑（甘藥制備字Z20190402000），由血竭、檀香、三七、茯苓、細(xì)辛、冰片、琥珀及人參等八味藥組成，用于治療證屬血脈淤阻氣滯血瘀型的冠心病。天水市中醫(yī)院的多年臨床經(jīng)驗(yàn)表明，竭香定痛膠囊可有效改善冠心病急性發(fā)作期的心前區(qū)疼痛、胸悶、氣短、乏力心悸等癥狀，并有效降低C 反應(yīng)蛋白及低密度脂蛋白[3-4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)與生物醫(yī)藥發(fā)展相融合的一門新興技術(shù)，其通過分析藥物、靶點(diǎn)與疾病之間的相互作用，借助節(jié)點(diǎn)的連接和關(guān)系，闡明中藥組分-疾病靶點(diǎn)作用機(jī)制[5]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析竭香定痛膠囊治療冠心病的作用機(jī)制，以期為竭香定痛膠囊的進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 竭香定痛膠囊有效成分及作用靶點(diǎn)獲得

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（即計(jì)算機(jī)系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，traditional Chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform，TCMSP，網(wǎng)址：http://tcmspw.com/tcmsp.php）中篩選竭香定痛膠囊藥物組方的有效成分，篩選條件如下：所篩選的每味藥有效成分的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%，類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18。復(fù)制所有藥物組方的全部作用靶點(diǎn)基因（relate targets），應(yīng)用Perl Critic 軟件交互與有效成分相關(guān)的靶基因，并剔除無(wú)名稱基因。

1.2 冠心病靶點(diǎn)的獲得及藥物-疾病共有基因獲得

以“Coronary heart disease”為關(guān)鍵詞在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/search/advanced/geneMap）及GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）中檢 索疾病基因靶點(diǎn)并匯總。采用R 語(yǔ)言x64 4.0.1 版本軟件對(duì)所得藥物有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射分析，獲得藥物-疾病共有基因。

1.3 中藥調(diào)控及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Perl 軟件分析所得藥物-疾病共有基因的網(wǎng)絡(luò)，再采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 對(duì)中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建疾病-有效成分-作用靶點(diǎn)的三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

將藥物-疾病共有基因結(jié)果導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）Multiple proteins 中，物種選擇“Homo sapiens”，設(shè)置“higher confidence 0.700”，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，以構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因本體功能富集和基因組百科全書通路富集

采用R 語(yǔ)言x64 4.0.1 版本軟件bioconductor BiocManager 程序包將藥物-疾病交互基因轉(zhuǎn)化為Gene ID，利用bioconductor 中“DOSE”“clusterProfiler”及“pathview”程序包，應(yīng)用該軟件對(duì)所得Gene ID 進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集富集和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，設(shè)置Pvalue Cutoff 及Qvalue Cutoff均為0.05。

2 結(jié)果

2.1 竭香定痛膠囊有效成分及作用靶點(diǎn)基因篩選

在TCMSP 篩選出竭香定痛膠囊共59 個(gè)有效成分，4747 個(gè)藥物相關(guān)靶基因，采用Perl Critic 軟件篩選剔除無(wú)名稱基因，共得到36 個(gè)有效成分的804 個(gè)基因。

2.2 中藥-疾病共有基因獲得

以“Coronary heart disease”為關(guān)鍵詞在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)及GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索冠心病基因靶點(diǎn)8488 個(gè)（去重后7453 個(gè)），應(yīng)用R 語(yǔ)言將其與竭香定痛膠囊有效成分靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集，得竭香定痛膠囊藥物組分-冠心病共有基因100 個(gè)（圖1）。

圖1 竭香定痛膠囊治療冠心病的靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 中藥調(diào)控及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建冠心病-竭香定痛膠囊-作用靶點(diǎn)的的三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖2，封四），結(jié)果顯示，共有竭香定痛膠囊通過36 種有效成分作用于100 個(gè)中藥-疾病共同靶點(diǎn)，有效成分為：山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、異牡荊素（isovitexin）、常春藤皂苷（hederagenin）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）等。

圖2 冠心病-竭香定痛膠囊-作用靶點(diǎn)的的三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

將所得100 個(gè)竭香定痛膠囊與冠心病共有基因?qū)隨TRING 中，選擇高度相關(guān)性（high confid ence 0.700）獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3，封四），結(jié)果顯示，其中含有100 個(gè)共有基因節(jié)點(diǎn)及390 條邊，PPI 富集后P 值為＜1.0e-16，表明所建立的PPI 網(wǎng)絡(luò)較預(yù)期的互動(dòng)更為顯著。

圖3 竭香定痛膠囊與冠心病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

采用R 語(yǔ)言軟件分析PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前30 位的靶點(diǎn)，縱向?yàn)榛蛎Q，橫向?yàn)榛蜴溄庸?jié)點(diǎn)數(shù)目，結(jié)果見圖4，由圖可知絲裂原激活蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8）基因鏈接節(jié)點(diǎn)數(shù)目最大，為32，其次為表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白細(xì)胞介素-6（intedeukin-6，IL-6）連接點(diǎn)數(shù)目均為26，雌激素受體基因1（estrogen receptor gene 1，ESR1）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor，VEGFA）基因排名第四，連接點(diǎn)為25，其他基因是胱天蛋白酶3（CASP3）、MYC、細(xì)胞周期素D1（cyclin D1，CCND1）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators activate the receptor γ，PPARG）等。

圖4 竭香定痛膠囊與冠心病交互作用條形圖

2.4 GO 及KEGG 富集分析

在R 語(yǔ)言中安裝“DOSE”“clusterProfiler”及“pathview”程序包，將所得drug-disease 轉(zhuǎn)化為Gene ID，并對(duì)所得Gene ID 進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析，得GO條目126 條，KEGG 通路116 條（P 值、Q 值均＜0.05），選用前20 條，分別得GO 及KEGG 富集柱狀圖及氣泡圖。

GO 富集分析柱狀圖及氣泡圖結(jié)果見圖5（封四），結(jié)果顯示，竭香定痛膠囊-冠心病共有基因涉及人體功能包括：核受體的活動(dòng)、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、 半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、氧化還原酶活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、單氧酶活動(dòng)、核激素受體結(jié)合、雌激素受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等功能。

圖5 GO 富集圖

KEGG 通路富集分析柱狀圖及氣泡圖結(jié)果見圖6（封四），竭香定痛膠囊有效成分作用于冠心病的部分通路基因靶點(diǎn)的結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，竭香定痛膠囊有效成分作用靶基因參與疾病調(diào)控，涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路、 液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染信號(hào)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等。

圖7 竭香定痛膠囊治療冠心病KEGG 富集中的部分信號(hào)通路

3 討論

冠心病屬于中醫(yī)“胸痹”的范疇，胸痹是一本虛標(biāo)實(shí)之證，正虛（心氣虛和心陰虛）是其內(nèi)因，氣滯、血瘀、痰濁是冠心病的繼發(fā)因素[6-7]。竭香定痛膠囊是天水市中醫(yī)醫(yī)院從“調(diào)脾護(hù)心，溫陽(yáng)活血”治療原則出發(fā)，總結(jié)出的冠心病治療經(jīng)驗(yàn)制劑，由人參、茯苓、血竭、三七、冰片、檀香、細(xì)辛及琥珀八味藥組成，全方共奏調(diào)脾護(hù)心、溫陽(yáng)活血、通脈定痛之功。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，顯示竭香定痛膠囊中共36 個(gè)有效成分作用于冠心病基因靶點(diǎn)，其中槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）、異牡荊素（isovitexin），常春藤皂苷（hederagenin）、豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）等有效成分基因靶點(diǎn)數(shù)目較多?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，槲皮素可通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)14-3-3 η 蛋白表達(dá)水平，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制mPTP 開放，最終減少細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗心肌缺血再灌注損傷[8-9]，而山奈酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）和異鼠李素（isorha mnetin）可以顯著抑制細(xì)胞分化終末期的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARG、重組人CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（recombinant human CCAAT enhancer binding protein，C/EBPα）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）的表達(dá)，而影響其下游與脂質(zhì)合成相關(guān)的酶和蛋白的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)[10-11]。此外，豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（β-sitosterol）等植物甾醇，作為膽固醇類似物可抑制膽固醇腸道吸收，進(jìn)而降低血液中膽固醇水平、降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。另外，人參皂苷對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷具有一定保護(hù)作用[14]。

中藥-疾病-基因三元調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，竭香定痛膠囊通過以上多種成分作用于MAPK8、EGFR、IL-6、ESR1、VEGFA、CASP3、MYC、CCND1 及PPARG 等100 個(gè)基因。其中MAPK8 鏈接點(diǎn)數(shù)目最大，MAPK8 是促分裂原活化的蛋白激酶家族中的一員，又稱為JNK1/SAPK1 基因，是MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的信號(hào)分子，涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等各種機(jī)制[16]。研究表明，MAPK8 是TNF-α 促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡、抑制脂肪細(xì)胞分化、促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞去分化、 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂解等作用的上游重要信號(hào)分子[17]，MAPK8 可通過誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C 而啟動(dòng)死亡信號(hào)途徑和細(xì)胞凋亡，并可降低分化脂肪細(xì)胞抗凋亡特性[17]。而KEGG 富集的信號(hào)通路包含細(xì)胞凋亡途徑、TNF-α 途徑，提示竭香定痛膠囊可能通過以上途徑上調(diào)MAPK8 基因表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減少脂肪細(xì)胞的分化成熟和聚集。

此外，VEGF 及ESR1 基因與冠心病相關(guān)，如VEGFA 基因多態(tài)性可增加冠心病風(fēng)險(xiǎn)，已經(jīng)證實(shí)雌激素受體的基因ESR1 和ESR2 降低雌激素對(duì)心血管功能的編碼，它們分別編碼了ERα 和ERβ，其中前者參與血管舒張、心肌細(xì)胞凋亡、刺激新血管的形成[18-19]，而在絕經(jīng)后婦女冠心病的發(fā)生中，ERα 參與調(diào)節(jié)的miR-214 可以抑制VEGF 的表達(dá)和生理功能，通過調(diào)控VEGF 來(lái)影響絕經(jīng)后婦女冠心病的發(fā)病過程[20]。本文GO 和KEGG 富集結(jié)果顯示，竭香定痛膠囊涉人體類固醇激素受體活性、雌激素受體結(jié)合活動(dòng)及流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療冠心病的作用，提示竭香定痛膠囊有效成分，可能通過以上基因途徑達(dá)到治療冠心病的目的。

綜上所述，竭香定痛膠囊治療冠心病時(shí)存在多分子、多基因靶點(diǎn)及多通路協(xié)作機(jī)制，可能通過槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、異鼠李素（isorhamnetin）、木犀草素（luteolin）等多種成分調(diào)控MAPK8、EGFR、IL-6、ESR1、VEGFA 基因蛋白的表達(dá)，從而影響人體核受體的活動(dòng)，配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過程、氧化還原酶活性、雌激素受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等功能、氧化還原酶活性（減少氧分子），并調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路、 液體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路、TNF 信號(hào)通路及細(xì)胞凋亡通路等多種方式治療冠心病。