杜秀鳳，史淑瓊，陳淑芬，鐘進(jìn)，宋春林，朱曉丹

(廣東省佛山市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，廣東 佛山 528000)

0 引言

頸部透明層厚度(nuchal translucency，NT)，是指孕 11 ～ 13+6周胎兒頸后皮膚的厚度，由頸后部皮下組織內(nèi)液體積聚形成的無回聲帶，一般情況下NT會隨孕周的增加而上升，孕14周后胎兒淋巴系統(tǒng)發(fā)育完全，胎兒頸項(xiàng)部積聚的液體迅速引流而不再進(jìn)展。孕早期胎兒頸項(xiàng)透明層增厚是指大于頭臀徑相對應(yīng)的NT值正常范圍的第95百分位數(shù)。NT 增厚與染色體異常的發(fā)生呈正相關(guān)，還與微缺失/微重復(fù)綜合征、胎兒心臟或骨骼畸形、重型地中海貧血、努南綜合征等的發(fā)病有關(guān)[1-3]。本研究通過分析 NT 增厚胎兒的超聲及介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果，在傳統(tǒng)的染色體核型分析基礎(chǔ)上同時(shí)檢測高通量測序染色體拷貝數(shù)變異(CNV-seq)，對 NT 增厚胎兒的遺傳學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析，為無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)(NIPT)及CNV-seq在孕婦胎兒染色體非整倍體篩查中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持，總結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年1月至2020年7月在佛山市婦幼保健院進(jìn)行早孕期胎兒超聲檢查，結(jié)果顯示NT增厚的361例單胎妊娠胎兒為研究對象。其胎兒超聲檢查結(jié)果顯示，胎兒頭臀徑長(CRL)為45～84mm，NT值為2.5～12.9mm，孕婦年齡19～45歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單胎；②胎兒超聲檢查孕周滿足11～13+6周；③胎兒NT值＞第95百分位或≥3.0mm，45mm≤CRL≤84mm；④其他：排除了自身惡性腫瘤、染色體異常、干細(xì)胞移植手術(shù)等。

1.2 方法

1.2.1 超聲檢查

在孕11～13+6周進(jìn)行，選擇腹部超聲檢查，胎兒自然姿勢取正中矢狀面，盡可能將圖像放大，使圖像只顯示胎兒頭部及上胸，胎兒頸部皮膚與軟組織間半透明組織間的最大厚度值重復(fù)測量3次，取最大數(shù)值。

1.2.2 高通量基因測序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)

抽取孕婦外周血10mL，于48h內(nèi)進(jìn)行血漿分離并純化，提取樣本的血漿DNA。將帶有序列標(biāo)簽的接頭引物用于構(gòu)建血漿DNA文庫。利用illumina NextSeq CN500平臺進(jìn)行大規(guī)模并行基因組測序。應(yīng)用生物信息工具放大并分析外周血中不同染色體水平的差異，將每個(gè)樣本測序的序列與人類參考基因組進(jìn)行比對，最終得出胎兒患染色體非整倍性風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.3 染色體核型分析

對NIPT高風(fēng)險(xiǎn)及NT異常的孕婦進(jìn)行遺傳咨詢，知情同意后進(jìn)行絨毛膜穿刺(11～13+6)或羊水穿刺(17～24周)，取得的標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片并經(jīng)G顯帶染色，在光學(xué)顯微鏡下分析染色體核型。

1.2.4 染色體拷貝數(shù)變異檢測(CNV-seq)從羊水中提取微量(50～100ng)

基因組DNA，通過超聲法將大片段DNA打碎，通過末端標(biāo)記、接頭連接和PCR擴(kuò)增進(jìn)行DNA文庫的構(gòu)建。使用美國illumina公司NextSeq CN500測序儀器平臺，對樣品DNA 進(jìn)行大規(guī)模平行測序，測序結(jié)果通過生物信息分析，與公共數(shù)據(jù)庫(OMIM、DGV、DECIPHER、UCSC和Pubmed)進(jìn)行比對，將染色體拷貝數(shù)變異分為五類：致病、可能致病、良性、可能良性和臨床意義不明(VOUS)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

胎兒NT值為2.5～14.8mm，單純性NT增厚胎兒262例(72.6%)，伴其他超聲異常胎兒99例(27.4%)，其中單純NT增厚胎兒有35例無創(chuàng)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)。所有孕婦平均年齡31.72歲(19～45歲)，其中高齡103例(28.5%)。所有病例均行介入性產(chǎn)前診斷，12例絨毛取樣、349例羊膜腔穿刺術(shù)，361例均同時(shí)行染色體核型分析及CNV-seq檢測，共檢出異常核型71例(19.7%)，正常核型290例(80.3%)。

2.2 NT增厚胎兒無創(chuàng)基因檢測(NIPT)結(jié)果分析

35例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)中，31例21三體高風(fēng)險(xiǎn)，4例18三體高風(fēng)險(xiǎn)，后經(jīng)絨毛活檢及羊膜腔穿刺分析胎兒染色體核型與NIPT結(jié)果一致。

2.3 NT增厚胎兒染色體核型結(jié)果分析

71例異常核型中非整倍體67例(94.4%)、結(jié)構(gòu)異常3例(4.2%)、嵌合體1例(1.4%)；21三體綜合征共44例、18三體綜合征共13例、13三體綜合征共1例、性染色體三體9例包 括1例47,XXX、1例47,XYY、2例47,XXY、5例45,X；染色體結(jié)構(gòu)異常3例：分別是46,XN,del(8)(q24.1)；46,XN,der(2)t(2；4)(q37.3：p15.2)pat；47,XN,+i(12)(p10)；嵌 合 體1例：47,XN,+3[33]/47,XN,+18[67]，表1。

表1 361例NT 增厚胎兒染色體核型結(jié)果分析

2.4 NT增厚胎兒CNV-seq結(jié)果分析

361例 胎 兒 中，112 例(31.0%)檢 出 CNVs，其 中 致 病性 CNVs79例(21.9%)，VOUS 21例(5.8%)，良 性 CNVs 12例(3.3%)。致病性CNVs79例，其中71例與前文染色體核型異常結(jié)果一致，CNV-seq在 290例核型正常胎兒中額外檢出8例(2.8%)致病性 CNVs 及 21例(7.2%)VOUS，表2。

表2 正常染色體核型胎兒中8例致病性 CNVs結(jié)果

3 討論

3.1 英國學(xué)者在90年代初在超聲檢查中發(fā)現(xiàn)早孕期胎兒頸部皮下均存在無回聲帶特征，并使用頸部透明層來描述這一現(xiàn)象，后更多學(xué)者發(fā)現(xiàn)早孕期頸后皮下積水有不同表現(xiàn)，有無分隔及多分隔水囊瘤，在孕14周后可逐漸消退或形成頸部皮膚皺褶。NT增厚的病因與頸淋巴囊匯入淋巴系統(tǒng)失敗有關(guān)，淋巴液受阻后積聚在頸部，頸后皮膚就會增厚。淋巴回流障礙僅是NT增厚的病理原因之一，透明基質(zhì)增加和膠原纖維網(wǎng)發(fā)育紊亂使唐氏綜合征胎兒頸部發(fā)生海綿樣改變而液體積聚，心力衰竭時(shí)靜脈回流障礙、骨骼發(fā)育不良使胸腔縮窄、胎兒非免疫性水腫等都可以導(dǎo)致NT增厚。NT增厚的眾多原因中，胎兒染色體異常是最重要的，特別是21三體綜合征，此外三倍體、18三體綜合征、13三體綜合征及性染色體非整倍體等胎兒也會出現(xiàn)增厚[4]。黃冬冰[5]對382例NT≥3 mm孕婦進(jìn)行研究結(jié)果顯示NT 增厚胎兒染色體核型異常檢出率為 22.4%，以 21- 三體為主(54.1%)；黃婷婷[6]對208 例 NT≥2.5 mm孕婦行介入性產(chǎn)前診斷，致病性染色體異常檢出率為 23.56%，主要為 21-三體綜合征；王宏[7]研究549例NT≥3.0mm孕婦的產(chǎn)前診斷結(jié)果認(rèn)為 T21、T18、T13、Turner綜合征的 NT均值分別為4.0mm、5.1mm、6.3mm、6.5mm，染色體異常的概率與NT增厚成正比。本研究發(fā)現(xiàn)NT增厚胎兒的致病性染色體異常以非整倍體為主，發(fā)生率94.4%(67/71)，NT增厚的判斷臨界值是2.5mm還是3.0mm，目前國內(nèi)學(xué)者還沒有共識，尚需進(jìn)一步研究。

3.2 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)(Noninvasive prenatal genetic testing，NIPT)

提取孕婦外周血中胎兒游離 DNA，檢測胎兒是否患 21三體、18三體、13 三體綜合征，與傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查相比較有著更高的準(zhǔn)確率及更低的假陽性率，且已在臨床應(yīng)用中取得顯著成效，避免了一部分不必要的有創(chuàng)性穿刺風(fēng)險(xiǎn)如流產(chǎn)、感染、羊水滲漏等。Liang[8]等的研究發(fā)現(xiàn)基因組的表達(dá)與GC含量呈線形關(guān)系，通過大規(guī)模平行測序技術(shù)NIPT對24種染色體非整倍體的檢測都是可行的，針對T21、T18、T13、T9和性染色體非整倍體的靈敏度為100%，特異度為99.71%。史淑瓊[9]等研究認(rèn)為NIPT在臨床工作中可以提高篩查能力，減少不必要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷操作。翟敬芳[10]研究認(rèn)為NT異常聯(lián)合NIPT對胎兒非整倍體陽性預(yù)測率為20.51%，單胎妊娠高齡孕婦胎兒染色體非整倍體異常可采用兩者聯(lián)合篩查方式。我們產(chǎn)前診斷中心的研究經(jīng)驗(yàn)一般以孕早期NT超聲為首要檢查項(xiàng)目，NIPT可做為補(bǔ)充檢查項(xiàng)目，兩者聯(lián)合可大大提高臨床對染色體疾病的檢出能力及減少漏診。

3.3 CNV-seq對標(biāo)本基因組進(jìn)行測序

測序結(jié)果通過生物信息學(xué)分析，與人類參考基因組進(jìn)行比對，可發(fā)現(xiàn)受檢標(biāo)本全部的23對染色體非整倍體及染色體變異大于100KB的微缺失/微重復(fù)。Liang[11]對72例樣本進(jìn)行回顧性臨床研究，認(rèn)為CNV-seq和微陣列比較基因組雜交技術(shù)對于目前已知致病拷貝數(shù)變異都能達(dá)到相同的檢測率，但CNV-seq在某些致病性未知的CNVs檢測上更能發(fā)現(xiàn)新的染色體疾病，具有良好的特異性及可重復(fù)性。Zhu[12]聯(lián)合運(yùn)用CNV-seq與SNPArray技術(shù)對115例產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)異常的羊水標(biāo)本進(jìn)行檢測，認(rèn)為CNV-seq可以替代SNPArray用于產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)異常的胎兒染色體檢測中。Liu[13]等比較了傳統(tǒng)核型分析與CNV-seq在檢測與自發(fā)流產(chǎn)相關(guān)的染色體異常方面的效能，研究結(jié)果表明，CNV-Seq與核型分析相比具有檢測時(shí)間短、可檢測嵌合體以及檢測所需樣本量低等優(yōu)勢。本研究共發(fā)現(xiàn)致病性CNVs79例，其中71例與傳統(tǒng)染色體核型異常結(jié)果一致，CNV-seq在290例核型正常胎兒中額外檢出8例(2.8%)致病性CNVs及21例(7.2%)VOUS。

NT不僅可以確定孕齡，也是篩查早孕期胎兒染色體異常的有效指標(biāo)，對于NT增厚胎兒建議有資質(zhì)的醫(yī)生進(jìn)行遺傳咨詢，可選擇染色體核型分析及高通量測序技術(shù)的染色體拷貝數(shù)變異檢測(CNV-seq)，并充分告知各種檢測的覆蓋范圍及局限性，并需要在孕中期進(jìn)行系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及胎兒心臟超聲篩查，這對降低先天缺陷兒的出生，優(yōu)生優(yōu)育及提高人口素質(zhì)有重要意義。