劉 美,胡玥玥,3,刁紅錄,3,4,5,張昌軍,3,5*

[1.十堰市人民醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院)生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰 442000;2.湖北省生殖醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，十堰 442000;3.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000;4.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000;5.胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室，十堰 442000]

隨著二胎政策的開放，越來越多的高齡女性加入生育大軍，但這部分患者的妊娠率較年輕患者明顯降低，胚胎整倍體性是非常重要的因素。植入前胚胎非整倍體遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A)技術(shù)可將整倍體胚胎篩選出來，從而提高高齡女性的妊娠率。關(guān)于胚胎整倍體的研究很多，其影響因素多為女性年齡，其他因素提及甚少。本文從臨床的角度，探討囊胚整倍體率的臨床影響因素，以期為臨床提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧研究2018年4月至2020年12月在湖北省十堰市人民醫(yī)院生殖中心行PGT-A助孕的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)(以下標(biāo)準(zhǔn)滿足任何一項即可)：(1)女方高齡(女方年齡38歲及以上)；(2)不明原因反復(fù)自然流產(chǎn)(自然流產(chǎn)2次及以上)；(3)不明原因反復(fù)種植失敗(移植3次及以上或移植高評分卵裂期胚胎數(shù)4～6個或高評分囊胚數(shù)3個及以上均失敗)；(4)嚴(yán)重畸形精子癥。納入人群中夫婦染色體核型均為正常，不明原因的反復(fù)種植失敗不要求連續(xù)性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)進入試管嬰兒周期后因各種原因未能取卵或受精；(2)取卵后因各種原因要求取消活檢；(3)無可活檢囊胚者；(4)活檢后拒絕檢測；(5)數(shù)據(jù)不完整；(6)夫妻雙方之一染色體異常。最終共納入166個周期(150例患者)，年齡25～47歲，患者均行遺傳咨詢并簽署PGT-A相關(guān)同意書。

1.2 促排卵及受精

1.2.1 超促排卵 PGT患者主要采用2種促排卵方案：黃體期長方案和高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案。黃體期長方案：黃體中期開始給予曲普瑞林(達必佳或達菲林)0.1mg/d，皮下注射，連用14～20d，給予促性腺激素150～300IU/d，皮下注射，待主導(dǎo)卵泡直徑達到18～20mm，給予艾澤250μg及絨促性素(HCG)2000IU板機。高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案：月經(jīng)第2～3d開始給予促性腺激素100～225IU/d，皮下注射及安宮黃體酮8～10mg/d，口服，待主導(dǎo)卵泡直徑達到20～22mm，給予達必佳0.1mg及HCG 2000IU板機。

1.2.2 囊胚活檢及檢測 扳機后36～39h行經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)，取卵后采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)受精，并將胚胎培養(yǎng)至受精后5～6d，即囊胚期，從4BB及以上囊胚取出4～7個滋養(yǎng)外胚層細胞進行胚胎活檢，將活檢后的囊胚進行玻璃化冷凍。將活檢的滋養(yǎng)外胚層細胞進行單細胞擴增，并進行擴增產(chǎn)物文庫構(gòu)建，遺傳學(xué)分析方法采用嘉寶仁和公司illumina二代測序平臺檢測胚胎染色體的整倍性。整倍體囊胚的定義：檢測報告單提示為46，XN。非整倍體囊胚的定義：檢測報告單提示除外46，XN以外的所有囊胚，包括：嵌合體、染色體片段的缺失、重復(fù)。我中心PGT-A可檢測>4Mb片段性重復(fù)或缺失和>30%比例嵌合體。

1.2.3 血清維生素B12、空腹血糖及血清TSH水平檢測 進入試管嬰兒周期前3個月內(nèi)檢測維生素B12、空腹血糖及血清TSH水平。血清TSH水平、血清維生素B12水平檢測均使用貝克曼的UniCel DxI 800，采用化學(xué)發(fā)光法?？崭寡菫榭崭?～10h的清晨靜脈血。

1.3 觀測指標(biāo) 囊胚整倍體率的臨床影響因素，囊胚的整倍體率=檢測的整倍體囊胚/所有檢測的囊胚。

1.4 研究方法 將患者按囊胚整倍體率分為兩組：囊胚整倍體率≤50%者103例，囊胚整倍體率>50%者63例。比較兩組間有顯著差異的變量，將篩選出有顯著差異的變量做多因素分析。將年齡(低齡組：≤35歲；高齡組：>35歲)和維生素B12(維生素B12低水平組：≤497.39pmol/L；維生素B12高水平組：>497.39pmol/L)分層，進一步研究這兩者對囊胚整倍體率的影響。

2 結(jié) 果

2.1 基本臨床資料 共納入166個周期(150例患者)，共獲卵1413枚，其中MⅡ卵1244枚，共計活檢囊胚469個，其中整倍體囊胚243個(51.81%，243/469)，非整倍體囊胚226個(48.18%，226/469)。兩組的男方年齡、女方年齡、血清維生素B12水平、獲卵數(shù)、促排卵方案比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者各臨床因素的比較

2.2 囊胚整倍體率二元logistics回歸結(jié)果 將男方年齡、女方年齡、血清維生素B12水平、獲卵數(shù)、促排卵方案為自變量，囊胚整倍體率為因變量,行二元logistics回歸分析。結(jié)果顯示，女方年齡和血清維生素B12水平是囊胚整倍體率的獨立影響因素(OR=0.840，95%CI為0.738～0.957，P<0.01；OR=1.001，95%CI為1.000～1.002，P=0.045)。選擇年齡和血清維生素B12水平對囊胚整倍體率高于50%進行預(yù)測，預(yù)測準(zhǔn)確性為68.1%。見表2。

表2 囊胚整倍體率二元logistics回歸結(jié)果

2.3 低齡組和高齡組中不同水平維生素B12對囊胚整倍體率的影響 低齡組中，維生素B12低水平組和維生素B12高水平組的整倍體率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(58.00% vs 63.16%，P=0.347)。在高齡組中，維生素B12低水平組和維生素B12高水平組的整倍體率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(24.36% vs 41.38%，P=0.035)。見表3、4。

表3 低齡組(≤35歲)不同水平維生素B12的組間比較

表4 高齡組(>35歲)不同水平維生素B12的組間比較

3 討 論

胚胎質(zhì)量是影響試管嬰兒成功率的重要因素，非整倍體形成主要是由卵母細胞第一次減數(shù)分裂(MI)中同源染色體(二價體)的錯誤分離引起的[1]。研究表明，PGT-A可明顯改善高齡(大于35歲)及反復(fù)妊娠丟失患者的妊娠結(jié)局[2-3]，而胚胎活檢并不會增加子癇前期、妊娠相關(guān)高血壓、胎盤疾病、早產(chǎn)或低出生體重及妊娠期糖尿病的發(fā)病風(fēng)險[4]。在一次取卵中獲得更高比例的整倍體胚胎至關(guān)重要，女方年齡是已知的因素，其與胚胎的非整倍體呈正相關(guān)[5-6]，但其他因素能否影響胚胎的整倍體率尚不明確。

3.1 AMH與胚胎整倍體率 AMH與胚胎整倍體率的相關(guān)性尚存爭議。既往研究表明，卵巢儲備功能減退與胚胎或胎兒非整倍體增高有關(guān)[7-8]。研究認為，在37歲以下不孕女性中，血清AMH和整倍體胚胎的比率呈顯著正相關(guān)，而在37歲以上女性中兩者則無顯著相關(guān)性[9]。Jiang等[10]認為,女性年齡大于35歲時，胚胎非整倍體率在不同的AMH分組中有顯著差異，但在小于35歲患者中無明顯相關(guān)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，AMH并非胚胎整倍體率的獨立影響因素。本研究中年齡中位數(shù)為33歲，結(jié)論與Jiang等相似。

3.2 Gn量與胚胎整倍體率 李為玉及張晉寧等[11-12]均認為，外源性Gn用量對胚胎非整倍體率均無明顯影響。本研究認為，Gn量與胚胎整倍體率無關(guān)，與上述研究結(jié)論相似。

3.3 空腹血糖與胚胎整倍體率 關(guān)于空腹血糖對胚胎整倍體率影響的報道甚少。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病的ART患者，如血糖控制良好或尚可，結(jié)局同血糖正常組，而血糖控制不佳則影響卵子和胚胎質(zhì)量[13]。有針對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，胚胎培養(yǎng)液中葡萄糖濃度越高，內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)外胚胎層細胞減少越明顯[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠卵泡中顆粒細胞凋亡明顯增加[15]，推斷血糖增高可能影響卵子質(zhì)量和胚胎質(zhì)量。本研究并未發(fā)現(xiàn)，胚胎整倍體率和空腹血糖有關(guān)。可能是因本研究中患者的空腹血糖在正常范圍內(nèi)或輕微升高。對于空腹血糖明顯異常的患者，空腹血糖水平和胚胎整倍體率是否有關(guān),需進一步研究。

3.4 血清TSH與胚胎整倍體率 關(guān)于TSH是否影響胚胎整倍體的報道甚少。有研究發(fā)現(xiàn)，TSH并不是胚胎染色體異常的獨立危險因素[16]。研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)TSH水平與MII卵率、受精率、2PN率、2PN卵裂率、種植率無關(guān)[17]。本研究并未發(fā)現(xiàn)胚胎整倍體率與基礎(chǔ)TSH有關(guān)。但本研究中所有甲狀腺功能異常者在取卵前均接受了治療，如不治療，異常的TSH是否增加胚胎整倍體率不明確，有待進一步研究。

3.5 血清維生素B12與胚胎整倍體率 大量研究提示，維生素B12缺乏可能導(dǎo)致胚胎停育[18-19]。對于血清維生素B12對胚胎整倍體的影響，文獻報道極少，大部分是對于卵子質(zhì)量和胚胎質(zhì)量的報道。1981年Scott等報道，細胞內(nèi)維生素B12水平下降，MTR/MTRR活性降低，一碳代謝受阻[20]。有研究對哺乳動物的卵母細胞在體外進行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)體系在一碳缺乏的條件下，竇卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟均受到損害，如補充維生素B12可改善胚胎質(zhì)量[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在輔助生殖技術(shù)中，維生素B12缺乏可導(dǎo)致卵泡液同型半胱氨酸濃度升高，與卵母細胞和胚胎質(zhì)量受損相關(guān)，從而降低輔助生殖技術(shù)的成功率[23-25]。還有研究報道，低水平維生素B12和胚胎發(fā)育延遲相關(guān)[26]。上述研究均提示維生素B12缺乏導(dǎo)致卵泡和胚胎發(fā)育延遲或胚胎質(zhì)量受損。本研究和上述研究結(jié)果類似，血清維生素B12水平是囊胚整倍體率的獨立影響因素，對年齡進行分層后發(fā)現(xiàn)，在年齡及其他條件相似的情況下，維生素B12低水平組的整倍體率低于維生素B12高水平組，在低齡組兩者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在高齡組兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其可能機制：維生素B12為甲硫氨酸合成酶的輔酶，維生素B12缺乏時可導(dǎo)致甲硫氨酸合成酶活性降低。同型半胱氨酸甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼岬倪^程受阻，導(dǎo)致甲硫氨酸及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)含量降低，而同型半胱氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)堆積，SAM/SAH比例下降，導(dǎo)致DNA轉(zhuǎn)甲基酶活性受到抑制，出現(xiàn)DNA低甲基化，會增加染色體不分離的風(fēng)險[27]。此外，SAM生成受阻會影響DNA、RNA合成、修復(fù)造成細胞分化、發(fā)育異常和凋亡,導(dǎo)致DNA甲基化的紊亂，造成基因表達抑制、染色體的失活等[28]。相比于年輕女性，高齡女性維生素B12水平對囊胚整倍體率的影響原因不明，可能原因為，與年輕女性相比，高齡女性同型半胱氨酸水平本身會生理性升高，如維生素B12攝入不足，會導(dǎo)致同型半胱氨酸水平進一步升高，而同型半胱氨酸水平升高與卵母細胞和胚胎質(zhì)量受損相關(guān)[24]。已有研究表明，孕婦MTHFR C677T基因突變導(dǎo)致的高同型半胱氨酸血癥與胎兒染色體非整倍體相關(guān)[29]，異常升高的同型半胱氨酸水平導(dǎo)致囊胚整倍體率更低。

綜上所述，女方年齡和血清維生素B12水平均為囊胚整倍體率的獨立影響因素。相比于年輕女性，高齡女性維生素B12水平對PGT-A技術(shù)助孕患者囊胚整倍體率的影響更大。血清維生素B12水平在何種范圍能達到更高的囊胚整倍體率，值得進一步研究。