張帥源， 付昊杰， 秦 碩， 李光輝， 易雅群， 孫明磊

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，河南 鄭州 450052）

在全球范圍內(nèi)，口腔頜面部惡性腫瘤每年新發(fā)病例超過(guò)60 萬(wàn)，約占所有癌癥的10%，是臨床上最為常見的惡性腫瘤之一[1-2]，其好發(fā)于舌、頰、牙齦、頜骨、唾液腺等重要解剖部位，嚴(yán)重危害人類的健康[3]。 飲酒、吸煙、咀嚼檳榔、長(zhǎng)期物理化學(xué)因素刺激以及人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus, HPV）感染等是口腔頜面部惡性腫瘤最主要的發(fā)病因素[4-6]。 治療方面，根據(jù)口腔頜面部惡性腫瘤患者的臨床分期，可選擇不同的治療方案，如手術(shù)切除、放療、化療、及綜合序列治療等。 早期腫瘤（Ⅰ期或Ⅱ期）患者可采用單純手術(shù)治療或放療，并有較大的治愈可能，但臨床多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）， 其中部分患者已錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī)，只能采用放化療等姑息療法，預(yù)后較差[3,7]。 因此，早期發(fā)現(xiàn)腫瘤并及時(shí)有效地治療， 對(duì)提高口腔頜面部腫瘤患者的生存率及生活質(zhì)量至關(guān)重要。 目前臨床上迫切需要一種便捷、高效的檢查手段，用于惡性腫瘤的早期診斷和篩查， 這對(duì)于改善癌癥患者的預(yù)后有著重要的臨床意義。 目前，臨床上一般依靠切取活檢， 局部穿刺等組織病理學(xué)檢查來(lái)診斷，創(chuàng)傷較大且效率較低。 近年來(lái)CTCs 等“液體活檢”[8]技術(shù)的出現(xiàn)，使得通過(guò)外周血檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物來(lái)獲取更為全面有效的腫瘤臨床病理相關(guān)信息成為可能[9]。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs）是從原發(fā)腫瘤脫落到鄰近血管，隨后出現(xiàn)在惡性腫瘤患者血液循環(huán)中的癌細(xì)胞[10]。 有文獻(xiàn)報(bào)道，CTCs 的數(shù)量和分子特征與腫瘤負(fù)荷、癌癥進(jìn)展、對(duì)抗治療的反應(yīng)及患者生存率顯著相關(guān)[11]。 由于CTCs 在血樣中非常罕見（1×109個(gè)正常血細(xì)胞中僅有1~10 個(gè)CTCs）且半衰期較短等因素，傳統(tǒng)方法難以準(zhǔn)確檢測(cè)[12]。隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，最新的陰性富集及靶向PCR 檢測(cè)技術(shù)成功地解決了上述問題。 該方法基于CTCs 與正常血細(xì)胞表面抗原CD45＋之間的表達(dá)差異， 利用免疫磁珠將兩者分離并最大限度地將CTCs 純化，大幅提高了檢測(cè)質(zhì)量[13-14]。 葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)R）是一組跨膜蛋白，分為 α、β 和 γ 3 種亞型， 由于FR 在人體大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞中均有特異性的高表達(dá)，如卵巢癌、肺癌、頭頸部癌等，而在正常組織中極少表達(dá)， 是一種理想的CTCs 檢測(cè)靶點(diǎn)。最新研究表明，CTCs 在結(jié)直腸癌[15]、肺癌[16]、泌尿系惡性腫瘤等[17]癌癥的臨床診治中有著重要的指導(dǎo)意義， 但目前CTCs 在口腔頜面部惡性腫瘤的相關(guān)研究較少見。本研究以腫瘤表面FR 為靶點(diǎn)，應(yīng)用陰性富集及靶向PCR（FR+CTC）檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)口腔頜面部惡性腫瘤患者外周血的CTCs 值， 分析其與病理分期、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)的關(guān)系， 探討CTCs 檢測(cè)的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2019 年5 月—2020 年5 月間鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的119 例口腔頜面部惡性腫瘤患者為實(shí)驗(yàn)組，同期選取20 例健康志愿者為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組中，男性 78 例（65.5%），女性 41 例（34.5%），年齡 16~89 歲，平均年齡（52.71±13.44）歲；病理類型包括：鱗狀細(xì)胞癌93 例，黏液表皮樣癌11 例，腺樣囊性癌6 例，唾液腺導(dǎo)管癌6 例，肌上皮癌3 例。對(duì)照組中，男性 9 例（45%），女性 11 例（55%），年齡22~69 歲，平均年齡（44.60±12.66）歲。 本研究納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理診斷為口腔頜面部惡性腫瘤；②無(wú)其他部位原發(fā)惡性腫瘤；③入院前未接受放療、化療及手術(shù)等其他相關(guān)治療。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前曾接受放療、化療及手術(shù)等其他相關(guān)治療； ②嚴(yán)重感染或肝腎功能嚴(yán)重異常；③生活不能自理或不能配合治療者。

1.2 CTCs 的富集與檢測(cè)

CTCs 的檢測(cè)采用負(fù)向富集及靶向PCR 檢測(cè)技術(shù)。 嚴(yán)格遵循采血標(biāo)準(zhǔn)，取患者3 mL 靜脈血，血樣中加入紅細(xì)胞裂解液孵育， 紅細(xì)胞裂解后離心，加入CD45+磁珠結(jié)合白細(xì)胞， 用磁場(chǎng)捕獲并去除白細(xì)胞，剩余富含CTCs 的細(xì)胞群，加入特異性探針（針對(duì)表達(dá)葉酸受體α 的細(xì)胞設(shè)計(jì)，由靶向葉酸受體的葉酸單元與共價(jià)偶聯(lián)的寡核苷酸單元組成） 標(biāo)記CTCs，離心，去除上清液，游離探針，加入洗脫劑，洗脫與CTCs 特異性結(jié)合的探針，制備待測(cè)樣品，加入PCR 擴(kuò)增試劑后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR 擴(kuò)增 （PCR 擴(kuò)增模板的寡核苷酸單元序列為：5′-CTCAA CTGGT GTCGTT GGGCA ATTCA GTTGA TT CTAA-3′），經(jīng)數(shù)據(jù)分析，計(jì)算出3 mL 血樣中的CTCs 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.0.0 統(tǒng)計(jì)軟件（R Foundation for Statistical Computing，奧地利）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)， 多組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。 應(yīng)用受試者工作曲線（receiver operating characteristic curve，ROC） 分 析 外 周 血CTCs 對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌 （oral squamous cell carcinoma，OSCC）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值，并通過(guò)其靈敏度和特異度來(lái)計(jì)算約登指數(shù)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血CTCs 值的比較

實(shí)驗(yàn)組CTCs 值較對(duì)照組明顯升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。 見表 1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CTCs 值的比較Table 1 Comparison of CTCs values between experimental group and control group

2.2 外周血CTCs 與口腔頜面部惡性腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組CTCs 值與患者的性別、年齡、原發(fā)灶部位等無(wú)關(guān)（P＞0.05）。與惡性腫瘤的周圍組織浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與腫瘤負(fù)荷、腫瘤T 分期和N 分期呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 M1 期患者的 CTCs 值較 M0期顯著增高，Ⅲ、Ⅳ期患者的CTCs 值高于Ⅰ、Ⅱ期者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 外周血CTCs 與OSCC 臨床病理特征的關(guān)系Table 2 The relationship between CTCs and clinicopathological characteristics of OSCC

2.3 外周血CTCs 對(duì)口腔頜面部惡性腫瘤的診斷價(jià)值

CTCs 診斷惡性腫瘤的曲線下面積 （area under curve，AUC）值為 0.932（表 3），檢驗(yàn)?zāi)苄杂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，95%CI 為 0.916~0.950），當(dāng)血 CTCs值是8.45 FU/3 mL 時(shí)，約登指數(shù)最大為0.866，診斷口腔頜面部惡性腫瘤的靈敏度為91.6%， 特異度95.0%。 見圖 1。

圖1 CTCs 檢測(cè)診斷口腔頜面部惡性腫瘤的ROC 曲線Figure 1 The ROC curve of CTCs in diagnosis of oral and maxillofacial malignancies

表3 CTCs 用于頜面部惡性腫瘤診斷的ROC 曲線分析結(jié)果Table 3 The ROC analysis of CTCs in diagnosis of maxillofacial malignant tumors

2.4 外周血CTCs 檢測(cè)對(duì)口腔頜面部惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值

CTCs 診斷腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC 值為0.693，檢驗(yàn)?zāi)苄杂薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.003，95%CI 為0.690~0.744），當(dāng) CTCs 值為 12.25 FU/3 mL 時(shí)，約登指數(shù)最大為0.434，敏感度69.0%，特異性74.4%。 見表 4、圖 2。

表4 CTCs 用于診斷腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC 曲線分析結(jié)果Table 4 The ROC analysis of CTCs in diagnosis of tumor lymph node metastasis

圖2 CTCs 檢測(cè)診斷口腔頜面部惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的ROC 曲線Figure 2 The ROC curve of CTCs in diagnosis of oral and maxillofacial malignancies metastasis

3 討論

目前CTCs 與腫瘤的臨床相關(guān)性研究較多，雖然各研究之間存在一定差異，但總體而言，CTCs 與腫瘤發(fā)生、發(fā)展之間存在著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。 Chen等[18]的研究表明，非小細(xì)胞肺癌患者較健康人CTCs值升高（P＜0.001）。 Ding 等[19]的研究顯示，在肺腺癌中Ⅲ、Ⅳ期患者的CTCs 值較Ⅰ、Ⅱ期高（P=0.000），腫瘤體積大的患者比腫瘤體積小的患者CTCs 高（P=0.001）。 Lou 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中， 發(fā)生轉(zhuǎn)移患者較未轉(zhuǎn)移者的 CTCs 高 （P=0.045）。

本研究應(yīng)用當(dāng)前最新的陰性富集及靶向PCR檢測(cè)技術(shù)，有較高的參考價(jià)值。 檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組CTCs 值明顯升高，表明CTCs 的升高與惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，與Chen 等[18]的研究結(jié)果一致。 通過(guò)繪制受試者工作曲線（ROC 曲線），計(jì)算出外周血CTCs 診斷口腔頜面部惡性腫瘤的AUC值為0.932， 通過(guò)其靈敏度及特異度計(jì)算出約登指數(shù)為 0.866， 該數(shù)值對(duì)應(yīng)的外周血 CTCs 值為8.45 FU/3 mL，此時(shí)靈敏度與特異度均＞90%，有較高的檢驗(yàn)效能， 用于臨床可有效區(qū)分出惡性腫瘤。當(dāng)CTCs 值＜8.45 FU/3 mL 時(shí)患癌可能性較小，若高于此值，則需密切隨訪并行必要的檢查排查腫瘤的可能。 本研究發(fā)現(xiàn)， 口腔頜面部惡性腫瘤患者的CTCs 水平與腫瘤負(fù)荷、T 分期及N 分期呈正相關(guān)，有腫瘤周圍組織浸潤(rùn)者較無(wú)浸潤(rùn)者CTCs 水平明顯升高， 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CTCs 水平高，表明CTCs 水平與腫瘤負(fù)荷、臨床分期、腫瘤周圍組織浸潤(rùn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。 另外，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者較無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的CTCs 水平高， 與Lou 等[20]的研究結(jié)果相一致。 口腔頜面惡性腫瘤較易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移， 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相對(duì)少見， 本研究著重評(píng)估CTCs 對(duì)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值。 運(yùn)用淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組的數(shù)據(jù)繪制ROC 曲線， 計(jì)算出AUC 值為0.693，約登指數(shù)為0.434，相對(duì)應(yīng)的CTCs值為12.25 FU/3 mL， 靈敏度為69.0%， 特異度為74.4%。 臨床應(yīng)用中，當(dāng)患者 CTCs 值＞12.25 FU/3 mL時(shí)有較大的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能。 另外在CTCs 與患者臨床分期相關(guān)性研究中也發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ期患者相較于Ⅰ、Ⅱ期患者CTCs 水平明顯升高，這與Ding 等[19]的研究結(jié)果一致。 以上結(jié)果表明，CTCs 在口腔頜面部惡性腫瘤的輔助診斷、 評(píng)估腫瘤的負(fù)荷大小、臨床分期、有無(wú)周圍組織浸潤(rùn)、有無(wú)轉(zhuǎn)移傾向，以及量化反映腫瘤的活躍程度和疾病的進(jìn)展?fàn)顩r等方面都有重要的臨床意義。

本研究也存在一定的不足， 由于隨訪時(shí)間較短，未能進(jìn)行完整的療效相關(guān)性分析，后續(xù)作者將延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，進(jìn)一步探討CTCs 對(duì)口腔頜面部惡性腫瘤療效評(píng)估的價(jià)值。 另外對(duì)照組納入的人數(shù)較少，后續(xù)可擴(kuò)大樣本量，以精確CTCs 在健康人中的趨近值。