李家琳， 蘇儉生

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海 200072）

細(xì)胞膜包被的仿生納米載體是利用細(xì)胞膜包被納米技術(shù)（cell membrane coating nanotechnology），將天然細(xì)胞的細(xì)胞膜融合到核心微納米顆粒上所構(gòu)建的仿生納米遞送體系[1]。這些雙層結(jié)構(gòu)的仿生納米載體在保留核心納米載體自身理化性能的同時， 其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)還能繼承類似于原始細(xì)胞的生物學(xué)功能，在利用細(xì)胞膜特性及源細(xì)胞生物功能的同時， 搭載納米顆粒，負(fù)載藥物或因子，發(fā)揮抗炎、減傷、生物解毒等作用。目前，已成功構(gòu)建的仿生納米載體所采用的細(xì)胞膜來源包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、干細(xì)胞及其他細(xì)胞如細(xì)菌、血小板、癌細(xì)胞等[2-4]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞極化在炎癥調(diào)節(jié)和修復(fù)過程中發(fā)揮著重要的作用。 通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞經(jīng)典活化M1 型向替代活化M2 型的表型轉(zhuǎn)換，能夠促進(jìn)炎癥由損傷走向修復(fù)的進(jìn)程，這一點在牙周炎這一口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最常見的慢性細(xì)菌感染性疾病中也得到了驗證[5-7]。 姜黃素（curcumin，Cur）是一種天然抗炎、抗氧化及抗腫瘤的多酚類藥物[8-9]，被證實能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2 型的極化[10]。 但游離的Cur 仍存在生物利用度低、水溶性差、代謝消除速率過快等不足。 此外，組織工程技術(shù)在牙周炎中的作用也不容小覷。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作為組織工程的種子細(xì)胞，近來研究發(fā)現(xiàn)還可表現(xiàn)出較強的免疫調(diào)節(jié)功能。 其膜結(jié)構(gòu)在組織再生和細(xì)胞交流中均具有重要作用[11]，能夠趨向炎癥、腫瘤等部位，參與到免疫抑制、抗炎、和維持組織穩(wěn)態(tài)的過程中[12]。

基于此， 本實驗擬構(gòu)建負(fù)載Cur 的MSCs 細(xì)胞膜包被的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米顆粒（Cur-loaded, MSCs membrane-coated poly [lacticco-glycolic]nanoparticles,Cur-PLGA-NPs），利用 MSCs細(xì)胞膜趨向炎癥部位行使細(xì)胞膜相關(guān)的抗炎和骨保護(hù)功能；同時利用納米核心，在炎癥微環(huán)境中釋放Cur，調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2 型極化。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

姜黃素（MCE 公司，美國）；PLGA（75:25，相對分子質(zhì)量 30 000；濟南岱崗公司，中國）；DMEM 培養(yǎng)基、α-MEM 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS；HyClone 公司，美國）；胎牛血清（FBS；Gibco 公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒、TRIzol（TaKaRa 公司，日本）；CCK-8 試劑盒、BCA 試劑盒、 考馬斯亮藍(lán)快速染色液（碧云天公司，中國）；脂質(zhì)體擠出器（Avanti Lipids 公司，美國）；聚碳酸酯膜（200 nm、400 nm；Whatman 公司，美國）；Dounce 勻漿器（Sigma 公司，美國）；超速離心機（Beckman 公司，美國）；Zetasizer Nano ZS 粒度分析儀（Malvern 公司，英國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 麻醉并處死2~3 周齡的SD 大鼠，用注射器沖洗去除骨骺端的股骨及脛骨新鮮骨髓腔至含有10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中， 并于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，間隔2~3 d 換液。待細(xì)胞密度80%~90%時胰蛋白酶消化法傳代。 后續(xù)實驗均選用第3 代細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2 MSCs 細(xì)胞膜的分離 采用Yang 等[13]的MSCs細(xì)胞膜分離方法獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜囊泡（mesenchymal stem cells plasma membranes, MSCPMs）。 胰酶消化收集對數(shù)生長期的MSCs， 用冰的PBS 清洗2~3 次后收集于3 mL 分離緩沖液中，4 ℃1 000×g 離心 5 min 收集沉淀。 之后將沉淀轉(zhuǎn)移至Dounce 勻漿器的勻漿緩沖液中，冰浴條件下反復(fù)研磨 20~30 次充分勻漿裂解細(xì)胞，4 ℃ 3 500×g離心 5 min，保留上清，去除沉淀于底層的細(xì)胞器等。 隨后，上清液 4 ℃ 100 000×g 超速離心 1 h，收集側(cè)壁沉淀獲得間充質(zhì)干細(xì)胞膜，將其分散于PBS中，-80 ℃短期保存。使用脂質(zhì)體擠出器擠壓干細(xì)胞膜， 依次選用 400、200 nm 的聚碳酸酯膜， 制備約200 nm 粒徑的干細(xì)胞膜囊泡備用。

1.2.3 Cur-PLGA-NPs 的制備 通過乳化-溶劑揮發(fā)法制備負(fù)載Cur 的PLGA 納米顆粒。 稱取20 mg PLGA 及2 mg Cur 充分?jǐn)嚢枞芙庥? mL 二氯甲烷及丙酮的混合溶劑中。 將溶液逐滴加入高速攪拌的2%聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）水溶液中，冰浴下超聲15~20 min 形成初乳。 將初乳逐滴加入0.5%的PVA 溶液中，過夜揮發(fā)去除有機溶劑。 5 500 r/min離心10 min 去除大顆粒沉淀， 取上清于 4 ℃、20 000 r/min 高速離心，收集納米粒。蒸餾水洗滌2~3 次后分散在少量蒸餾水中，凍干機過夜凍干，得到Cur-PLGA-NPs。 重復(fù)上述方法制備不含Cur 的空白納米粒。

1.2.4 PM-NP-Cur 的合成 將過量的MSC-PMs 與Cur-PLGA-NPs 充分混合均勻，質(zhì)量比約 1∶2，將混合物溶液裝入脂質(zhì)體擠出器中，反復(fù)擠壓通過400、200 nm 孔徑的聚碳酸酯膜。為使納米粒子被干細(xì)胞膜充分包被，實驗中反復(fù)擠壓約20~25 個循環(huán)。 擠壓完成后離心去除未包載的干細(xì)胞膜囊泡， 獲得MSCs 膜包被的 PLGA 納米顆粒（PM-NPs）。

1.2.5 PM-NP-Cur 的粒徑及形貌表征 將10 μL適當(dāng)濃度的樣本滴于銅網(wǎng)靜置， 用1%磷鎢酸溶液負(fù)染后于透射電子顯微鏡下分析觀察。 使用動態(tài)光散射儀（DLS）評估 Cur-PLGA-NPs 及 PM-NPs 的粒徑分布、zeta 電勢 （zeta potential） 和多分散指數(shù)（polydispersity index, PDI）。

1.2.6 MSC-PMs 表面蛋白的鑒定 BCA 試劑盒定量分析制備的MSC-PMs 和PM-NPs 的蛋白濃度。 取總蛋白含量相同的樣品20 μL，使用Bio-Rad 凝膠電泳系統(tǒng)在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 凝膠中進(jìn)行凝膠電泳實驗。待電泳條帶分離后，將電泳好的凝膠取下，置于托盤內(nèi)，加入蒸餾水搖床清洗。之后使用考馬斯亮藍(lán)超快速染色液進(jìn)行染色2 h。 染色后倒入脫色液過夜脫色，反復(fù)脫色2~3 次待凝膠背景清晰透明后拍攝。

1.2.7 PM-NP-Cur 的包封率及載藥率測定 取1 mg Cur 溶解于1 mL 丙酮中， 酶標(biāo)儀測定425 nm 處紫外吸光度， 繪制Cur 的濃度-紫外吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。取Cur-PLGA-NPs 及PM-NPs 分散于去離子水中，超聲振蕩破乳，收集上清液，加入丙酮定容，酶標(biāo)儀測定425 nm 處吸光度值，計算游離藥物含量。 按照如下公式計算包封率 （encapsulation efficiency，EE%）及載藥量（loading content，LC%）。

EE%=納米粒中裝載的藥物總量/初始投藥量×100%

LC%=納米粒中裝載的藥物總量/載藥納米?？傎|(zhì)量×100%

1.2.8 PM-NP-Cur 的體外釋放曲線及穩(wěn)定性分析 取1 mL PM-NP-Cur 溶液（10 mg/mL 的 PBS 溶液）置于透析袋內(nèi)（相對分子質(zhì)量7 000），將透析袋放入50 mL PBS 緩沖液中，37 ℃水平恒溫振蕩透析， 于不同的時間間隔取袋外1 mL 溶液測定吸光度， 計算析出藥物濃度，再補入同樣體積的PBS 緩沖液。 在每一個預(yù)設(shè)的時間點重復(fù)上一步驟。 繪制時間-藥物累積釋放量曲線。

1.2.9 PM-NP-Cur 對RAW264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定 將生長良好的RAW264.7 巨噬細(xì)胞以5×103個/孔接種于96 孔板中。配置不同濃度的PMNP-Cur 納米粒于完全培養(yǎng)基中，每孔加入完全培養(yǎng)基 100 μL。 將 96 孔板置于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后用CCK8 試劑盒測定吸光度值。

1.2.10 qPCR 分 析 PM-NP-Cur 對 RAW264.7 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)mRNA 的表達(dá) 將RAW264.7巨噬細(xì)胞以 5×104個/孔接種于 6 孔板內(nèi)，LPS（100 ng/mL）誘導(dǎo) 12 h 使其向 M1 型極化。 隨后使用不同濃度的 PM-NP-Cur（有效藥物濃度 0、5、10、15 μmol/L） 干預(yù) 12 h。 用 TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA， 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對獲得的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 得到各組cDNA。 以GAPDH 作為內(nèi)參基因，通過羅氏熒光定量檢測儀進(jìn)行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）。 引物序列見表 1。

表1 qPCR 引物序列Table 1 qPCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 進(jìn)行分析， 數(shù)據(jù)通過均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。 應(yīng)用 t 檢驗法比較組間差異，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cur-PLGA-NPs 的形貌表征及粒徑分布

透射電鏡（TEM）下Cur-PLGA-NPs 呈現(xiàn)分散均勻規(guī)則的球形（圖1A）。 為獲得最合適的包封效率，實驗中考察了Cur 與PLGA 在不同投料比下納米粒表征差異（表2、圖1B）。 結(jié)果顯示在其他條件恒定的情況下，隨著Cur 的投藥量增加，EE%減低，LC%在Cur 為3 mg 時達(dá)到峰值， 此時包封率不足40%，且聚合物分散性指數(shù)（PDI）＞0.1。因此實驗中綜合考慮，選擇投藥比 Cur∶PLGA 為 2 mg∶20 mg，此條件下納米粒平均粒徑（183.2±0.8） nm。

圖1 Cur-PLGA-NPs 的表征Figure 1 Characterization of Cur-PLGA-NPs

表2 不同投藥量對載藥量和包封率的影響Table 2 The influence of different drug input on LC% and EE%

2.2 PM-NPs 的表征TEM

圖像顯示PM-NPs 呈現(xiàn)均勻、 規(guī)整的球形納米形貌，且可見明顯的核-殼結(jié)構(gòu)，厚度均勻平行的脂質(zhì)雙分子層包裹在納米核心的表面（圖2A）。 動態(tài)光散射（DLS）測得Cur-PLGA-NPs 粒徑由包裹前的（183.2±0.8） nm 增加為（204.2±3.7） nm，zeta 電勢包裹前為-（8.94±0.42） mV， 經(jīng)細(xì)胞膜囊泡包裹后為-（27.14±0.96） mV， 與 MSC-PMs 的 zeta 電勢-（26.8±1.72） mV 相接近（圖 2B）。 SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果顯示，PM-NPs 膜蛋白與細(xì)胞膜表面的膜蛋白基本一致，表明材料合成過程中細(xì)胞膜的完整性良好（圖2D）。以上結(jié)果證明MSCs 已成功包覆在Cur-PLGA-NPs 納米粒子的表面。

圖2 PM-NPs 的表征Figure 2 Characterization of PM-NPs

2.3 PM-NP-Cur 的穩(wěn)定性分析和藥物釋放

PM-NP-Cur 及 Cur-PLGA-NP 納米粒在 PBS 中的粒徑變化（圖3A）顯示納米粒穩(wěn)定性良好。 釋放曲線（圖3B）觀察到前6 h 二者的釋放行為未見明顯差異， 存在前期突釋情況，12~24 hPM-NP-Cur 的突釋情況有所減輕。這表明PM-NP-Cur 能夠更長期穩(wěn)定地釋放藥物。

圖3 PM-NP-Cur 及Cur-PLGA-NP 的穩(wěn)定性分析和藥物釋放Figure 3 Stability and drug release profile of PM-NP-Cur and Cur-PLGA-NP

2.4 PM-NP-Cur 對 RAW264.7 巨噬細(xì)胞活性的影響

CCK8 實驗結(jié)果顯示PM-NP-Cur 與Cur-PLGANP 在相同濃度下對 RAW264.7 的細(xì)胞活性影響無明顯差異（圖 4）。 藥物有效濃度在 15 μmol/L 以下時，對RAW264.7 的細(xì)胞活性無明顯影響，因此選擇低于15 μmol/L 用于后續(xù)實驗。

圖4 PM-NPs 的RAW264.7 巨噬細(xì)胞毒性實驗Figure 4 RAW264.7 cell cytotoxicity test of PM-NPs

2.5 PM-NP-Cur 對RAW264.7 不同表型細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下，RAW264.7巨噬細(xì)胞M1 型相關(guān)炎癥因子iNOS、IL-1β 表達(dá)升高。 與LPS 刺激組相比，應(yīng)用PM-NP-Cur 的實驗組iNOS、IL-1β 的表達(dá)降低。 而 M2 型相關(guān)基因 Arg-1、IL-10、CD206 表達(dá)均增高， 且隨著 PM-NP-Cur 濃度的升高呈正向變化（圖 5，P＜0.05）

3 討論

隨著微納米載體的迅速發(fā)展，其展現(xiàn)出良好的治療牙周疾病的潛力。 一方面，其納米級的尺寸與DNA 和蛋白質(zhì)等生物大分子相近，通過設(shè)計特定的尺寸、形狀、表面屬性，納米?？梢源┻^牙周袋，甚至到達(dá)牙槽骨骨小梁，有選擇性地、精確地被輸送到作用部位[14]。 另一方面，雖然納米顆粒載體的優(yōu)點已經(jīng)明確， 其仍需躲避機體內(nèi)非特異性清除及調(diào)理素作用，以達(dá)到在牙周組織中藥物的長期穩(wěn)定釋放[15]。

基于上述需求，運用天然細(xì)胞膜進(jìn)行生物偽裝的納米仿生載體近年來已有諸多研究。 除原有的理化性能外，這些納米顆粒還能夠繼承源細(xì)胞膜的生物學(xué)特性及相關(guān)抗原與標(biāo)志物位點，在機體微環(huán)境中，充當(dāng)誘餌，吸收并中和病理分子[1,16]。同時還可以有效避免免疫清除的過程，利用細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能特性， 靶向作用于源細(xì)胞相關(guān)的效應(yīng)細(xì)胞或組織，有利于藥物持久、有效、特異性地靶向釋放。 相較于單一使用天然細(xì)胞或模擬天然細(xì)胞膜的脂質(zhì)體，天然細(xì)胞膜包被的納米顆粒還在避免免疫吞噬的同時穩(wěn)定藥物運輸?shù)倪^程， 有益于后期臨床應(yīng)用。 Yang 等[13]利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞膜包被聚合物納米粒進(jìn)行小鼠體內(nèi)腫瘤的靶向治療；Zhang 等[4]利用中性粒細(xì)胞的旁分泌作用， 即分泌胞外微囊泡，制備了中性粒細(xì)胞包膜納米粒并與誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎癥的股骨頭外植體共培養(yǎng)，觀察到該納米粒能夠穿入滑膜腔， 靶向炎癥關(guān)節(jié)區(qū)發(fā)揮抑制滑膜炎癥、減輕關(guān)節(jié)損傷、并促進(jìn)軟骨修復(fù)再生等作用。

材料的設(shè)計從牙周炎損傷的修復(fù)出發(fā)， 應(yīng)用MSCs 細(xì)胞膜包裹載有Cur 的PLGA 納米粒，希望利用MSCs 靶向牙周炎癥中骨組織炎癥部位， 促進(jìn)組織修復(fù)，并通過納米粒核心釋放Cur，促進(jìn)向M2 型巨噬細(xì)胞的極化。 MSCs 具有較低的免疫原性、較強的免疫抑制及調(diào)節(jié)、抗炎等作用[17]，同時MSCs 的膜結(jié)構(gòu)在組織再生和細(xì)胞交流中也具有重要作用[18]。通過直接或間接接觸的方式使MSCs 和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)， 發(fā)現(xiàn)MSCs 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化[19]；MSCs的膜外囊泡或外泌體能夠定位CD206 陽性的M2型巨噬細(xì)胞，靶向炎癥部位[12]。姜黃素亦被證實在活化PPAR、促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化中起到重要作用[10]。本實驗就這一材料的構(gòu)建及其體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的能力進(jìn)行了研究。

實驗中采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備納米核心，并篩選出最優(yōu)投料比。 其中溶劑采用丙酮和二氯乙烷的混合溶劑， 有利于后續(xù)超聲過程中乳劑的形成，并防止滴入PVA 時造成藥物過量損失。 合成PMNP-Cur 的過程主要通過重復(fù)物理擠壓法，從蛋白電泳結(jié)果中可以看出這一過程前后，細(xì)胞膜表面蛋白無明顯損耗，這也為后續(xù)體內(nèi)試驗保留材料的生物活性奠定了基礎(chǔ)。 從藥物釋放曲線中可以看出，在納米粒穩(wěn)定性基本一致的情況下，有干細(xì)胞膜包被的納米粒子早期向溶液中釋放的藥物較無細(xì)胞膜的PLGA 納米粒要少，表明其前期突釋過程在細(xì)胞膜的包裹下有所減緩，這也有利于藥物在體內(nèi)長期穩(wěn)定釋放， 有利于維持局部組織中的有效藥物濃度。

qPCR 結(jié)果顯示，與經(jīng)過LPS 刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞相比，PM-NP-Cur 在適宜的濃度下能夠有效抑制M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥基因的表達(dá)， 且隨著PM-NP-Cur 中有效藥物濃度的提升，呈現(xiàn)出劑量依賴性。 這一過程中實驗探索的藥物有效濃度小于15 μmol/L，而據(jù)文獻(xiàn)報道，單一使用姜黃素時，這一濃度約在25~30 μmol/L。 這一結(jié)果的差異可能與納米粒核心 PLGA 代謝產(chǎn)生的部分酸性產(chǎn)物有關(guān)。 這一結(jié)果表明，PM-NP-Cur 在不影響細(xì)胞活性的前提下，增加藥物濃度能夠促進(jìn)向M2 型巨噬細(xì)胞極化。

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了間充質(zhì)干細(xì)胞膜包被的載有姜黃素的PLGA 納米顆粒，其穩(wěn)定性及生物相容性良好， 且能夠有效地促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化， 為之后用于牙周炎的體內(nèi)治療提供了實驗基礎(chǔ)。