朱云峰，覃艷，曹萌，翟倩倩，李燕，王濤

近年來，由于人們飲食結構的改變，2 型糖尿病和肥胖病人逐年增加，嚴重威脅人民生命健康。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是2 型糖尿病的重要原因。脂肪組織是發(fā)生IR 的場所之一，多種脂源性細胞因子如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、瘦素、抵抗素等參與或調節(jié)IR。巨噬細胞（adipose tissue macrophages，ATMs）數量增多，會導致促炎表達型巨噬細胞增多。ATMs 游走到脂肪組織后，致使刺激物增加經典活化巨噬細胞（classically activated macrophage，M1）的招募作用，加重脂肪細胞的功能障礙，誘發(fā)IR。目前，ATMs已經成為治療IR的新靶點。

黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是傳統(tǒng)中藥黃芪的主要成分之一，具有增強免疫、抗腫瘤、抗氧化等功效。研究發(fā)現(xiàn)，APS 具有胰島素增敏作用，且無明顯的毒副作用，APS 干預能提高肥胖大鼠的葡萄糖輸注率。目前，APS 對脂肪組織巨噬細胞活化的影響還未知。本研究于2018年11月至2019年5月主要探討了APS 對TNF-α 誘導的巨噬細胞活化的影響及可能的作用機制，以期為APS用于改善IR提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

脂肪細胞株3T3-L1及ANA-1 巨噬細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；APS：含量90%，美國泛華公司，1000 毫克/支；胎牛血清：美國HyClone 公司；小鼠IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒、小鼠TNFα ELISA 試劑盒：上海滬峰生物科技有限公司；PCR試劑盒：日本Takara 公司、大連寶生物有限公司；互補DNA（cDNA）第一鏈合成試劑盒：美國Fermentas公司；引物由Primer 5.0 軟件設計，上海生工科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1

前體脂肪細胞的培養(yǎng)和誘導為成熟脂肪細胞 將3T3-L1 前體脂肪細胞接種于細胞培養(yǎng)板內，用含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%二氧化碳、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至80%～90%，加含終濃度0.5 mmol/L 1-甲基-3-異丁基黃嘌呤（IBMX）、1 μmol/L 地塞米松和終濃度為10 mg/L 的胰島素的10% 胎牛血清高糖DMEM 培養(yǎng)48 h。48 h 后換含終濃度為10 mg/L 的胰島素的10% 小牛血清高糖DMEM 再培養(yǎng)48 h。48 h后再換含10% 胎牛血清的高糖DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)。以后每2天更換一次含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液。誘導分化8～12 d，90% 的3T3-L1 細胞呈成熟脂肪細胞，用油紅O鑒定后用于實驗。

1.2.2

巨噬細胞培養(yǎng) ANA-1 巨噬細胞復蘇后，用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基置于37 ℃、5% 二氧化碳、97% 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據細胞生長狀況，每2～3 天更換一次新鮮的培養(yǎng)基。待細胞融合至80% 左右時，進行傳代培養(yǎng)或取對數生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3

共培養(yǎng)體系的建立 通過Transwell 共培養(yǎng)方式，將巨噬細胞種于上室，脂肪細胞種于下室。小室底部濾膜孔徑0.4 μm，細胞不能自由通過，但兩層間的培養(yǎng)液及細胞因子可以自由通過。實驗分為三組，空白對照組（NC）：常規(guī)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，不進行干預；TNF-α 誘導干預組（TNF-α 組）：含10 μg/L TNF-α 的培養(yǎng)基干預24 h；APS 干預組（APS+TNF-α 組）：含10 μg/L TNF-α 與0.10 g/L APS 的培養(yǎng)基共同干預24 h。每組設置3個復孔。培養(yǎng)結束后，收集細胞培養(yǎng)上清液和細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4

雙抗體夾心ELISA 測定IL-6、MCP-1 水平細胞培養(yǎng)上清液3500 r/min 離心10 min，取上清，分別參照IL-6、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）試劑盒操作說明書檢測其水平。

1.2.5

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測誘生型一氧化氮合酶（iNOS）和TNF-α 的mRNA水平Trizol試劑提取細胞總RNA，微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度。參照逆轉錄試劑盒操作說明書將RNA 逆轉錄為cDNA。然后以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。 引物序列：iNOS 正向5'-GTTCACCCAGTTGTGCATCG-3'，反向5'-ACTTGCGATGCTCCATGGTC-3'； TNF- α 正向5'-TCTCAAAACTCG AGTGACAAG-3'，反向5'-AGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3'；β 肌動蛋白（β-actin）正向5'-CCTTCCTTCTTGGGTATGG -3'，反向5'-TGTTGGCATAGAGGTCTTTAC-3'。擴增程序：95 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環(huán)。以β-actin為內參，采用2法計算iNOS和TNF-α的mRNA相對表達水平。

1.2.6

蛋白質印跡法（Western blotting）法檢測蛋白表達 RIPA蛋白裂解液提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg 蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳后，濕轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。5% 脫脂牛奶中封閉1 h 后，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋度1∶200），室溫孵育1 h。TBST 緩沖液洗膜后，加入ELC 顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.7

巨噬細胞趨化實驗 采用Transwell 共培養(yǎng)方式，小室濾膜孔徑8 μm 。將巨噬細胞種于上室，將脂肪細胞種于下室。實驗分組與“1.2.3”相同。培養(yǎng)結束后，取出小室，吸棄培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2 次。用棉簽擦去小室表面為遷移的細胞，加入4% 多聚甲醛固定30 min。PBS 清洗細胞2 次，加入0.4% 結晶紫染色15 min。PBS 清洗后，顯微鏡觀察巨噬細胞染色情況，并拍照，對遷移細胞進行計數。

2 結果

2.1 細胞培養(yǎng)結果觀察

前體脂肪細胞誘導為成熟脂肪細胞過程細胞形態(tài)如圖1；成熟脂肪細胞油紅O 染色結果如圖2，可見細胞體內脂滴明顯，圍繞細胞核一周；巨噬細胞形態(tài)如圖3。

圖1 3T3-L1前體脂肪細胞誘導為成熟脂肪細胞過程細胞形態(tài)（×100）：1A為誘導前；1B為誘導第4天；1C為誘導第8天；1D為誘導第12天 圖2 3T3-L1成熟脂肪細胞油紅O染色圖：2A為×100；2B為×400 圖3 ANA-1巨噬細胞培養(yǎng)情況（×100）

2.2 APS 抑制脂肪細胞因子IL-6、TNF

-α

、MCP-1的表達

重復測量方差分析結果顯示，與12 h 比較，培養(yǎng)24 h、48 h 時TNF-α 組和APS+TNF-α 組的細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯升高。與24 h 比較，48 h 時NC 組、TNF-α 組和APS+TNF-α組的細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯降低。細胞培養(yǎng)相同時間，與NC 組比較，TNF-α 組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA 水平均明顯升高；與TNF-α 組比較，APS+TNF-α 組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α mRNA水平均明顯降低。見表1。

表1 各組不同時間點上清液中白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）mRNA表達水平比較/±s

2.3 APS 抑制巨噬細胞中iNOS 的表達

與NC 組比較，TNF-α 組iNOS mRNA 和蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05）；與TNF- α 組比較，APS+TNF- α 組iNOS mRNA 和蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05）。 見圖2、表2。

表2 黃芪多糖（APS）對巨噬細胞誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達的影響/±s

圖2 黃芪多糖（APS）對巨噬細胞誘生型一氧化氮合酶（iNOS）表達的影響：A為巨噬細胞iNOS mRNA表達；B為巨噬細胞iNOS蛋白表達

2.4 APS 對脂肪細胞趨化巨噬細胞的影響

NC組、TNF-α 組與APS+TNF-α 組趨化巨噬細胞數整體比較

F

=145.043，

P

＜0.001。與NC 組（27.68 ± 4.25）個比較，TNF-α 組（88.34 ± 8.26）個顯著升高（

P

＜0.05）；與TNF- α 組比 較，APS+TNF- α 組（42.50 ±6.15）個顯著降低（

P

＜0.05）。

2.5 APS 激活巨噬細胞中AMPKα1/SIRT1 信號通路

與NC 組比較，TNF-α 組磷酸化AMP 活化蛋白激酶α1（p-AMPKα1）和沉默信息調節(jié)蛋白1（SIRT1）蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05）；與TNF-α組比較，APS+TNF-α 組p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05）。見圖3、表3。

圖3 巨噬細胞AMPKα1/SIRT1信號通路蛋白的表達

表3 黃芪多糖（APS）對巨噬細胞中AMPKα1/SIRT1信號通路的影響/±s

3 討論

人脂肪體積增大可引起脂肪組織容積的增加，釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等細胞因子，進而誘導巨噬細胞向脂肪組織游走，并活化巨噬細胞?；罨木奘杉毎尫鸥咚降腡NF-α、IL-6、IL-12等炎性細胞因子，這些炎性因子又以旁分泌或自分泌的方式使巨噬細胞與脂肪細胞相互作用，相互影響，調控炎癥反應。TNF-α 是一種具有多種生物功能的細胞因子，多種組織和細胞均可分泌TNF-α。脂肪組織是內源性TNF-α 的主要來源，主要由脂肪組織中的巨噬細胞分泌。MCP-1主要來源于巨噬細胞、單核細胞、內皮細胞等，巨噬細胞在MCP-1 的趨化作用下產生炎癥反應。本研究結果顯示，在TNF-α 誘導作用下，細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α、MCP-1 表達水平明顯升高，提示在TNF-α誘導作用下，巨噬細胞或者，產生了較多炎性因子。而APS干預后，IL-6、TNF-α、MCP-1表達水平明顯降低，提示APS 可降低巨噬細胞的活化，抑制巨噬細胞產生炎性因子。巨噬細胞游走到脂肪組織后，會加重脂肪細胞的功能障礙，產生IR。脂肪和脂肪間質分泌的MCP-1 增多對巨噬細胞具有趨化作用。本研究顯示，在TNF-α 誘導的誘導作用下，巨噬細胞趨化數明顯增加，而APS 的干預可降低巨噬細胞的趨化作用，提示APS可減輕IR。

在炎性細胞因子如內毒素、TNF-α 等刺激作用下，機體組織可表達iNOS，iNOS 通過催化合成大量一氧化氮。一氧化氮通過刺激巨噬細胞產生炎癥反應，促進周邊細胞產生炎癥或細胞毒性，加重自身免疫組織的損傷。iNOS 是公認的巨噬細胞活化的標志物。本研究結果顯示，TNF-α 誘導巨噬細胞后，iNOS mRNA 和蛋白表達水平升高，說明TNFα誘導導致巨噬細胞活化。APS作用后，TNF-α誘導的巨噬細胞iNOS mRNA 和蛋白表達降低，進一步說明APS可抑制TNF-α誘導的巨噬細胞活化。

AMP 活化蛋白激酶（AMPK）是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由催化亞基α、調節(jié)亞基β 和γ 組成。AMP 活化蛋白激酶α（AMPKα）可通過對靶蛋白的磷酸化調節(jié)，參與脂代謝。AMPK 活性的降低可導致血漿游離脂肪酸升高及脂質在體內的異位沉積，進而導致脂質代謝紊亂性疾病的發(fā)生。SIRT1是一種NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，可增加AMPKα 的活性。AMPKα/SIRT1 信號通路在脂肪組織脂代謝中發(fā)揮重要調控作用，激活AMPKα/SIRT1 信號通路可降低巨噬細胞炎性因子的分泌。本研究結果顯示，TNF-α誘導后，巨噬細胞p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白表達水平降低，說明細胞中AMPKα/SIRT1 信號通路受到抑制。APS 干預后，TNF-α 誘導的巨噬細胞p-AMPKα1 和SIRT1 蛋白表達水平升高，表明APS 可激活細胞中AMPKα/SIRT1信號通路。

綜上所述，APS 可降低脂肪組織巨噬細胞的炎癥反應及趨化作用，抑制巨噬細胞活化，其作用機制與激活細胞中AMPKα/SIRT1信號通路有關。

（本文圖1～3見插圖12-1）