馬國(guó)平，周洪亮，范智毅，趙霞，劉志輝作者單位：南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京009；南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 003

兒童功能性便秘是由多種因素引起的以糞便硬結(jié)、持續(xù)排便困難、排便次數(shù)減少等為主要癥狀的功能性腸胃疾病，是兒童最常見(jiàn)的消化道功能紊亂疾病之一。小兒消積通便方為江蘇省中醫(yī)院趙霞主任根據(jù)小兒的生理病理特點(diǎn)及兒童功能性便秘的病因病機(jī)自擬的臨床經(jīng)驗(yàn)方，本方由炒枳實(shí)、姜厚樸、炒白術(shù)、火麻仁、炒決明子、炒雞內(nèi)金、焦山楂、連翹和胡黃連組成。其中，炒枳實(shí)消食導(dǎo)滯為君，姜厚樸理氣除滿為臣，佐以炒白術(shù)健脾和胃，火麻仁、決明子潤(rùn)腸通便，炒雞內(nèi)金、焦山楂健胃消食，連翹清熱散結(jié)，胡黃連燥濕消積，共奏消食化積，潤(rùn)腸通便之功，主要用于小兒食積便秘的干預(yù)和治療，臨床應(yīng)用十?dāng)?shù)年，療效顯著。

本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)小兒消積通便顆粒中5-羥甲基糠醛、連翹苷、連翹酯苷A、胡黃連Ⅰ、胡黃連Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、橙黃決明素、厚樸酚的含量進(jìn)行研究，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（主機(jī)：1100 型，檢測(cè)器：G1314A 型紫外檢測(cè)器，美國(guó)Aglient 科技有限公司）；Sartorius BP-211D 電子分析天平（賽多利斯公司）；SK6200H 超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；Milli-Q純水儀（密理博科技有限公司）。

1.2 試藥

小兒消積通便顆粒由江蘇省中醫(yī)院生產(chǎn)（批號(hào)190220，190221，190222）；橙黃決明素（純度≥89.9%，批號(hào)111900-201303，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；5-羥甲基糠醛（批號(hào)160512），連翹酯苷A（批號(hào)181110），胡黃連苷Ⅱ（批號(hào)181107），柚皮苷（批號(hào)181119），橙皮苷（批號(hào)181106），胡黃連苷Ⅰ（批號(hào)180602），連翹苷（批號(hào)190103），厚樸酚（批號(hào)181105）均購(gòu)自南京聚康醫(yī)藥化工有限公司，純度≥98%；陰性制劑（除不加各組方藥材外，制備方法同小兒消積通便顆粒）由實(shí)驗(yàn)室制備；乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA有限公司），超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品、供試品及陰性溶液的制備

精密稱(chēng)取對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升分別含5-羥甲基糠醛、連翹苷、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅰ、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、橙黃決明素、厚樸酚190.00 μg、46.55 μg、108.70 μg、26.18 μg、22.50 μg、43.18 μg、91.09 μg、19.50 μg、39.55 μg的混合對(duì)照品溶液，備用。

取小兒消積通便顆粒約0.35 g，精密稱(chēng)定，置25 mL 帶塞錐形瓶中，加入70% 甲醇10 mL，精密稱(chēng)定，超聲30 min（功率280 W，頻率53 kHz），冷卻至室溫，加70% 甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)（0.45 μm），取續(xù)濾液，即得。

分別取缺胡黃連、焦山楂、姜厚樸、炒決明子、炒枳實(shí)、連翹的陰性制劑，制備方法同供試品溶液，分別制得各陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%磷酸-水溶液（A）-乙腈（B），按表1 進(jìn)行梯度洗脫；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。

表1 梯度洗脫表/%

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品溶液、小兒消積通便顆粒供試品溶液及小兒消積通便顆粒陰性供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行進(jìn)樣，得HPLC 色圖譜，見(jiàn)圖1。由圖1A 可得，各有效成分保留時(shí)間分別為1 號(hào)峰：5-羥甲基糠醛（12.640 min），2號(hào)峰：連翹酯苷A（35.968 min），3 號(hào)峰：胡黃連苷Ⅱ（36.956 min），4 號(hào)峰：柚皮苷（43.290 min），5 號(hào)峰：橙皮苷（44.916 min），6 號(hào)峰：胡黃連苷Ⅰ（48.259 min），7號(hào)峰：連翹苷（60.807 min），8號(hào)峰：橙黃決明素（77.655 min），9 號(hào)峰：厚樸酚（86.683 min）。供試品與對(duì)照品在相同位置有吸收，陰性供試品無(wú)干擾。

圖1 小兒消積通便顆?；旌蠈?duì)照品、供試品及各陰性樣品色譜圖：A 為混合對(duì)照品；B為供試品；C為缺胡黃連陰性樣品；D為缺焦山楂陰性樣品；E為缺姜厚樸陰性樣品；F為缺炒決明子陰性樣品；G為缺炒枳實(shí)陰性樣品；H為缺連翹陰性樣品

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1

線性關(guān)系 精密吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，分別加入甲醇稀釋成2、4、10、20、40倍的混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行含量測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)（r）

2.4.2

精密度試驗(yàn) 取稀釋2倍的混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定，計(jì)算，5-羥甲基糠醛、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黃連苷Ⅰ、連翹苷、橙黃決明素、厚樸酚的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.13%、0.38%、0.28%、0.44%、0.37%、0.61%、0.67%、0.45%、0.43%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.4.3

重復(fù)性試驗(yàn) 取190222 批小兒消積通便顆粒，分別精密稱(chēng)定約0.35g，共6份，依照“2.1”項(xiàng)下方法制備小兒消積通便顆粒供試品，按“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算。5-羥甲基糠醛、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黃連苷Ⅰ、連翹苷、橙黃決明素、厚樸酚的含量分別為158.15 μg/g、271.29 μg/g、43.18 μg/g、14.24 μg/g、171.56 μg/g、58.91 μg/g、25.47 μg/g、2.98 μg/g、9.21 μg/g；RSD分 別 為0.41%、0.32%、1.03%、2.34%、0.50%、0.54%、2.63%、2.60%、2.50%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

續(xù)圖1 小兒消積通便顆?；旌蠈?duì)照品、供試品及各陰性樣品色譜圖：A為混合對(duì)照品；B為供試品；C為缺胡黃連陰性樣品；D為缺焦山楂陰性樣品；E為缺姜厚樸陰性樣品；F為缺炒決明子陰性樣品；G為缺炒枳實(shí)陰性樣品；H為缺連翹陰性樣品

2.4.4

穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，依法分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算。5-羥甲基糠醛、連翹酯苷A、胡黃連苷Ⅱ、柚皮苷、橙皮苷、胡黃連苷Ⅰ、連翹苷、橙黃決明素、厚樸酚的峰面積RSD 為0.18%、0.25%、1.09%、1.82%、0.95%、0.56%、1.99%、1.60%、2.71%。結(jié)果表明，該供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5

加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取已知含量的小兒消積通便顆粒（190222批）約0.175 g，共6份，分別精密加入等量對(duì)照品，依“2.1”項(xiàng)下的操作制備小兒消積通便顆粒供試品溶液，測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確性良好。

表3 加樣回收率試驗(yàn)表（n=6）

續(xù)表3 加樣回收率試驗(yàn)表（n=6）

2.4.6

含量測(cè)定 分別稱(chēng)取小兒消積通便顆粒3批各0.35 g，精密稱(chēng)定，照“2.1”項(xiàng)下操作制備小兒消積通便顆粒供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3批樣品每袋的含量/（μg/g）

3 討論

小兒消積通便顆粒由炒枳實(shí)、姜厚樸、炒白術(shù)、火麻仁、炒決明子、炒雞內(nèi)金、焦山楂、連翹和胡黃連組成。炒枳實(shí)為君藥，其黃酮類(lèi)成分柚皮苷和橙皮苷是理氣、行滯、抗炎抗氧化的重要活性成分；姜厚樸為臣藥，其特征性成分厚樸酚可劑量依賴性增加回腸縱行肌收縮頻率和振幅，改善胃腸運(yùn)動(dòng)障礙和抗腹瀉；胡黃連中胡黃連苷Ⅰ和胡黃連苷Ⅱ、連翹中的連翹酯苷A 和連翹苷、決明子中的橙黃決明素和焦山楂中的5-羥甲基糠醛具有抗菌消炎、抗氧化的作用；故將上述活性成分作為小兒消積通便顆粒的指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，可對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行更全面的控制。

小兒消積通便顆粒含量測(cè)定方法研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：柱溫對(duì)胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ的分離度有一定影響，柱溫在20～30 ℃內(nèi)時(shí)對(duì)胡黃連苷Ⅰ與胡黃連苷Ⅱ變化較小，故擇常規(guī)柱溫25 ℃作為檢測(cè)柱溫。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，連翹、胡黃連、枳實(shí)中的成分檢測(cè)波長(zhǎng)均在270 nm左右，故選擇270 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)還比較了不同流動(dòng)相、不同分析時(shí)間等對(duì)色譜圖的影響，發(fā)現(xiàn)以0.2% 磷酸水作為流動(dòng)相，可改善連翹酯苷、胡黃連苷Ⅱ、橙皮苷等成分的峰形，故選擇0.2% 的磷酸水溶液作為流動(dòng)相。由于本研究涉及9 種成分的定量研究，分析時(shí)間對(duì)各峰的分離效果影響很大，前期實(shí)驗(yàn)嘗試了多種梯度條件均未能在短時(shí)間內(nèi)獲得較好的分離效果，而最終確定的色譜條件則兼顧了分離效果與分析時(shí)間。

方法學(xué)考察表明，該方法重復(fù)性好、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可為小兒消積通便顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考，同時(shí)還可為其醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑工藝過(guò)程研究與控制、穩(wěn)定性研究等奠定基礎(chǔ)。