李家和，許龍，曹陽，黃順旺

甘露醇注射液國內(nèi)有多家藥企生產(chǎn)，甘露醇靜脈作用快，很少發(fā)生反跳現(xiàn)象，為臨床上廣泛使用的脫超純水利尿藥，其在急性腎功能衰竭的預(yù)防、顱內(nèi)壓降低與腦水腫治療方面，屬于常用和首選的藥物。藥物中雜質(zhì)會影響穩(wěn)定性、降低療效，甚至對人體健康有害或產(chǎn)生副作用，有關(guān)物質(zhì)研究在一致性評價中尤為重要。根據(jù)CDE 已上市化學(xué)仿制藥（注射劑）一致性評價技術(shù)要求，參比制劑首選國內(nèi)上市的原研藥品（上海百特醫(yī)療用品有限公司），有關(guān)物質(zhì)研究重點對制劑及原料藥的降解產(chǎn)物進行研究。歐洲藥典EP9.0、美國藥典USP40及日本藥典JP17甘露醇原料標準均收載3個已知雜質(zhì)，即雜質(zhì)A（山梨醇）、雜質(zhì)B（麥芽糖醇）和雜質(zhì)C（異麥芽酮糖醇）。上述藥典與中國藥典甘露醇注射液標準中均未收載有關(guān)物質(zhì)檢查項。本研究于2018年1月至2019年6月建立并經(jīng)驗證的方法，可有效檢出甘露醇注射液中各已知雜質(zhì)，主峰與相鄰雜質(zhì)峰得到良好分離。其中，雜質(zhì)A（山梨醇）為甘露醇的異構(gòu)體，雜質(zhì)B（麥芽糖醇）為山梨醇與葡萄糖結(jié)合生成的雜質(zhì)，雜質(zhì)C（異麥芽酮糖醇）為甘露醇與山梨醇分別與葡萄糖從側(cè)端結(jié)合生成的雜質(zhì)。其結(jié)構(gòu)式如下所示。

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(tǒng)（島津LC-20A）：泵單元（LC-20AT），示差檢測器（RID-10A），色譜數(shù)據(jù)工作站（Labsolutions DB版）。

甘露醇對照品（批號100533-201304，99.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)A（批號170810，98.03%）購自上海展云化工有限公司；雜質(zhì)B（批號R022L0，99.8%）、雜質(zhì)C（批號R05510，96.6%）購自美國藥典會；供試用制劑（ 批號20181103、20181104、20181105）為安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；參比制劑（批號S1711090，規(guī)格250 mL∶50 g）購自上海百特醫(yī)療用品有限公司；市售制劑（批號17031312，規(guī)格100 mL∶20 g）購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；水為超純水。

圖1 甘露醇注射液中各已知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式：A為雜質(zhì)A（山梨醇）；B為雜質(zhì)B（麥芽糖醇）；C為雜質(zhì)C（異麥芽酮糖醇）

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

取本品，加超純水稀釋制成每毫升含50 mg 的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為各供試品溶液；精密量取2 mL，置100 mL量瓶，用超純水稀釋定容，搖勻，即自身對照溶液；取甘露醇對照品2.5 mg，置100 mL 量瓶中，加超純水溶解制成每毫升中含25 μg的溶液，作為0.05%對照溶液，即靈敏度溶液。

2.2 色譜條件和系統(tǒng)適用性

通過考察雜質(zhì)A、B、C 及主成分峰保留時間、主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度，進行了色譜條件的篩選，試驗方法和結(jié)果如下：按照高效液相色譜法（中國藥典2015 版四部通則0512）試驗：以填充劑為磺化交聯(lián)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物的強陽離子鈣型交換柱（300 mm×7.8 mm），以超純水為流動相，流速為0.5 mL/min，柱溫為80 ℃，示差折光檢測器，檢測溫度為40 ℃。取甘露醇對照品、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 各適量，加超純水配制成每毫升約含甘露醇50 mg、雜質(zhì)A 1.0 mg、雜質(zhì)B 1.0 mg、雜質(zhì)C 1.0 mg，取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2所示。各組分出峰順序依次為雜質(zhì)C（峰Ⅰ）、雜質(zhì)B和雜質(zhì)C（峰Ⅱ）、甘露醇、雜質(zhì)A，甘露醇峰與雜質(zhì)A 峰之間的分離度大于2.0，分離度符合要求，專屬性較高且各雜質(zhì)峰的理論板數(shù)均大于2000，系統(tǒng)適用性符合要求。

圖2 甘露醇注射液一致性評價系統(tǒng)適用性試驗色譜圖

2.3 專屬性

進行破壞性試驗以考察甘露醇降解產(chǎn)物在本方法條件下的分離情況。分別移取甘露醇注射液（批號20181103）2.5 mL 三份，置10 mL 量瓶中。第1份加1 mol/L鹽酸溶液2 mL，在40 ℃穩(wěn)定性試驗箱中反應(yīng)8 d，加超純水稀釋至刻度，搖勻，即得酸破壞樣品；第2 份加1 mol/L 氫氧化鈉溶液2 mL，在25 ℃穩(wěn)定性試驗箱中反應(yīng)16 d，加1 mol/L 鹽酸溶液2 mL中和，加超純水稀釋至刻度，搖勻，即得堿破壞樣品；第3 份加30% 雙氧超純水2 mL，在40 ℃穩(wěn)定性試驗箱中8 d，加超純水稀釋至刻度，搖勻，即得氧化破壞樣品。將甘露醇注射液（批號20181103）一瓶放置在80 ℃干燥箱中21 d，取2.5 mL，置10 mL 量瓶，用超純水稀釋定容，搖勻，即高溫破壞樣品。將甘露醇注射液（批號20181103）一瓶放置在5000 Lx 照度的穩(wěn)定性試驗箱中27 d，取2.5 mL，置10 mL 量瓶，用超純水稀釋定容，搖勻，即光照破壞樣品。精密量取上述各溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，色譜圖見圖3。結(jié)果可見：本品在酸、高溫、光照破壞條件下，未產(chǎn)生降解雜質(zhì)，在堿、氧化破壞后，主峰及雜質(zhì)A 與其相鄰雜質(zhì)峰分離度良好，破壞前后的物料基本守恒。

圖3 甘露醇注射液一致性評價專屬性試驗HPLC色譜圖

2.4 定量限、檢測限、線性范圍

分別稱取甘露醇對照品、雜質(zhì)A、B、C 對照品適量，配制成含甘露醇對照品、雜質(zhì)A、B、C 對照品約為50、250、500、1000、2000 mg/L 的混合溶液。其中檢測限信噪比約為3；定量限信噪比約為10。精密量取定量限溶液與上述各對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。對照品濃度作為橫坐標（

X

），峰面積作為縱坐標（

Y

），采用線性回歸分析，結(jié)果見表1。

表1 甘露醇與各已知雜質(zhì)定量限、檢測限與線性

結(jié)果表明：甘露醇濃度在4.32～2003.83 mg/L 范圍內(nèi)，雜質(zhì)A 濃度在5.12～1981.77 mg/L 范圍內(nèi)，雜質(zhì)B 濃度在4.11～1982.61 mg/L 范圍內(nèi)，雜質(zhì)C 濃度在6.92～1947.46 mg/L 范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度與準確度

精密度：按“2.1”項下方法制備供試品6 份，在“2.2”色譜條件下，以高效液相色譜儀進行測定，計算各雜質(zhì)含量相對標準差（RSD）。6 份供試品溶液中，超過報告限度（0.05%）雜質(zhì)（雜質(zhì)A）含量的RSD 為0.85%，小于5.0%，總雜RSD不大于5.0%，本方法精密度良好。

準確度：精密量取混合對照品貯備液，加入供試品中，制成加入各已知雜質(zhì)為限度的80%、100%、120% 的回收率樣品，進樣分析，記錄色譜圖，計算各已知雜質(zhì)回收率。雜質(zhì)A、B、C 的平均回收率依次為102.62%、101.36%、103.11%，RSD 依次為1.14%、1.01%、0.82%，本方法準確度良好。

2.6 溶液穩(wěn)定性

按“2.1”“2.2”項下制備供試品溶液與系統(tǒng)適用性溶液，25 ℃放置，并于0、2、4、6、8、12、24 h分別取樣進樣分析，記錄色譜圖。系統(tǒng)適用性溶液24 h 內(nèi)甘露醇的峰面積RSD 為0.13%，雜質(zhì)A 的峰面積RSD 為0.18%，雜質(zhì)B 的峰面積RSD 為0.17%；供試品溶液24 h 內(nèi)甘露醇主成分峰面積RSD 為0.14%，雜質(zhì)A 的峰面積RSD 為0.75%，RSD均小于2%，因此，系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定。

2.7 耐用性

通過分別調(diào)整色譜條件中的流速（±0.05 mL/min）、柱溫（±5℃）、檢測器溫度（±5℃）及更換不同色譜柱等，來考察雜質(zhì)與主成分之間分離度的影響及大于0.05% 雜質(zhì)含量變化。與正常條件比較，各條件下雜質(zhì)檢出個數(shù)一致，大于0.05% 單雜、總雜含量RSD符合要求，表明本方法耐用性良好。

2.8 樣品測定

按上述已確定的色譜條件及方法，檢查本品中試3批及參比制劑1批、市售制劑1批樣品的有關(guān)物質(zhì)。已知雜質(zhì)按加校正因子的自身對照法計算，未知雜質(zhì)按不加校正因子的自身對照法計算。結(jié)果見圖4。

圖4 甘露醇注射液有關(guān)物質(zhì)檢測色譜圖

由檢測結(jié)果可知，5 批樣品（20181103、20181104、20181105、市售制劑17031312、參比制劑S1711090）均能檢出已知雜質(zhì)A，依次為0.19%、0.20%、0.34%、0.50%、0.52%。未檢出已知雜質(zhì)B 和已知雜質(zhì)C，未知雜質(zhì)均小于報告限（0.05%），且3批自制樣品有關(guān)物質(zhì)總體不高于參比制劑與市售制劑。

3 討論

有關(guān)文獻僅研究了雜質(zhì)A 或完全參照中國藥典2015 版原料藥“甘露醇”有關(guān)物質(zhì)項下方法。本研究基于EP9.0 原料藥“Mannitol”有關(guān)物質(zhì)項下方法，同時結(jié)合各國藥典質(zhì)量標準，進行了色譜條件篩選、優(yōu)化。選用填充劑為磺化交聯(lián)的苯乙烯二乙烯基苯共聚物的強陽離子鈣型交換柱，色譜柱型號為BIO RADAminex HPX-87C（300 mm×7.8 mm），流速為0.5 mL/min，柱溫為80 ℃，示差折光檢測器溫度為40 ℃，主峰與各雜質(zhì)峰峰型良好，保留時間適宜。以超純水為流動相，可有效改善溶劑的負吸收峰，故選用上述條件確定了最終色譜條件。

參照中國藥典《藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則》，對已知雜質(zhì)A、B、C 進行了方法驗證研究，雜質(zhì)A、B、C 的校正因子均值依次為1.00、1.02、0.98，均在0.9～1.1 之間。參照《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，各已知雜質(zhì)含量均可采用主成分自身對照法計算。本研究建立的甘露醇注射液有關(guān)物質(zhì)檢測方法操作簡便、結(jié)果準確、重現(xiàn)性好，為該注射液質(zhì)量一致性評價提供試驗依據(jù)。