何驍+鄧莉莉

[摘要]目的 觀察兔自體骨髓基質(zhì)細胞作為種子細胞移植修復(fù)兔坐骨神經(jīng)長距離缺損的能力及其安全性，探討骨髓基質(zhì)細胞在坐骨神經(jīng)損傷模型內(nèi)分化為神經(jīng)元樣細胞的可行性。方法 兔骨髓基質(zhì)細胞分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)、鑒定以及傳代后注入坐骨神經(jīng)損傷的兔模型中，并于細胞移植后第1、2、4、8及16周分別行透射電鏡及免疫組化等方法觀察。結(jié)果 移植側(cè)與對照側(cè)神經(jīng)纖維均有不同程度再生，但對照側(cè)較移植側(cè)神經(jīng)纖維數(shù)量明顯減少（t=175.88，P<0.01）。結(jié)論 BMCSs移植能促進兔坐骨神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)，并與本身相容性良好，為細胞替代療法提供了樂觀的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]骨髓基質(zhì)細胞；細胞培養(yǎng)；自體移植；坐骨神經(jīng)

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0013-04

[Abstract]Objective To observe the ability and safety of autologous bone marrow stromal cells （BMSCs） as seed cells in repairing long distance defect of sciatic nerve in rabbits，and to explore the feasibility of BMSCs differentiating into neuron-like cells in sciatic nerve injury model.Methods BMSCs were injected into rabbit model of sciatic nerve injury，after isolated，cultured，induced，and identificated.Then electron microscope and immunohistochemisty were performed at the 1st，2nd，4th，8th and 16th weeks after cell transplantation.Results After transplantation，there were different degrees of regenerated nerve fibers between transplanted side and controlled side，but the number of nerve fibers was significantly reduced in control group，compared with the transplantation group （t=175.88，P<0.01）.Conclusion BMCSs transplantation has a well compatibility，which can promote the recovery of rabbit sciatic nerve dysfunction and provide an optimistic application prospect for cell replacement therapy.

[Key words]Bone marrow stromal cell；Cell culture；Autotransplantation；Sciatic nerve

長距離周圍神經(jīng)缺損的傳統(tǒng)治療方法是自體神經(jīng)移植，但此治療方式存在嚴重缺陷，如為獲取供體而導(dǎo)致的其他功能損害。目前干細胞的研究已逐漸深入，關(guān)于骨髓基質(zhì)細胞（bone marrow stormal cells，BMSCs）自體移植修復(fù)長距離神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究也越來越多，并逐漸成為熱點[1]。作為自身組織，骨髓具有來源豐富、取材容易、高分裂增殖性、多組織分化潛能及不受免疫排斥等優(yōu)點，這為細胞移植療法提供了樂觀的應(yīng)用前景[2]。

本研究旨在識別、跟蹤移植后BMSCs的存活狀態(tài)及與宿主神經(jīng)組織整合情況，最終為其進一步行體內(nèi)自體移植治療的實驗應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

選取體重為1.5～2.0 kg、約3月齡的新西蘭兔（New Zealand Rabite）10只，均由南華大學(xué)動物中心提供。

1.2試劑

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、兔神經(jīng)巢蛋白（nestin）抗體由Santa Cruz公司提供；FITC標記山羊抗小鼠IgG、生物素標記山羊抗小鼠IgG試劑盒均由Chemicon公司提供；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）由R&D公司提供；PKH67染料試劑盒、3，3-二氨基苯聯(lián)胺試劑盒（3，3-diaminobenzidinetetrahydrochloride，DAB）、細胞表皮因子（epidermal growth factor，EGF）、淋巴細胞分離液（percoll）、鼠抗單克隆神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）抗體均由Sigma公司提供；神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基來自于南方醫(yī)科大學(xué)實驗室，專利號為02134314.4。

1.3主要器材

組織剪、彎鉗、有齒鑷、血管鉗、顯微器械1套、縫針、無菌縫線、注射器、無菌操作臺等。

1.4實驗步驟

1.4.1骨髓采集、BMSC的分離、擴增及體外誘導(dǎo) 于兔耳緣靜脈將10%水合氯醛注入致其麻醉后，在無菌操作臺上抽取股骨遠端骨髓約4 ml。所獲取的骨髓用Hank液稀釋，細胞懸液與淋巴細胞分離液按1∶2比例混合，2500 r/min梯度離心15 min。將含核細胞的界面層吸出，加入1～2 ml雙蒸水吹打，加入干細胞培養(yǎng)基，800 r/min離心約5 min，去除上清后加相同培養(yǎng)基，并加10%胎牛血清接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中（圖1）。收集第三代細胞胞懸液加入本實驗室配制的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液及EGF（10 ng/ml）+LIF（10 ng/ml）+b-FGF（10 ng/ml）+FBS（1%終濃度），接種于24孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)5 d（圖2）。

1.4.2兔坐骨神經(jīng)損傷模型的制作 兔稱重從耳緣靜脈注入10%水合氯醛致麻醉后，于雙側(cè)髖部消毒，置于無菌臺并鋪手術(shù)單。行髖關(guān)節(jié)后入路，依次切開皮膚、皮下、淺深筋膜，仔細止血，彎鉗鈍性分離臀大肌，顯露坐骨神經(jīng)分叉處。在分叉上方切開神經(jīng)外膜，切除約8 mm長神經(jīng)。用微量注射器吸取神經(jīng)干細胞并注入神經(jīng)缺損區(qū)內(nèi)，縫合神經(jīng)外膜及肌膜以加強對移植干細胞的包裹力。對照側(cè)注射DMEM培養(yǎng)液。移植側(cè)及對照側(cè)隨機選擇，最后用明膠海綿包裹，在皮膚外標記實驗組移植側(cè)。將兔放入清潔籠具，預(yù)防感染，觀察生命體征。

1.4.3免疫組化染色 取細胞移植手術(shù)成功后1、2、4、8、16周的實驗新西蘭兔各2只，采用1%戊巴比妥鈉以100 mg/kg注射入腹腔后麻醉。消毒后打開胸腔，暴露心臟，導(dǎo)管插入左心室，生理鹽水快速沖洗，將4%多聚甲醛由插管處（pH7.4）灌注500 ml固定，由原切口切開皮膚皮下并暴露、剝離含移植干細胞段的坐骨神經(jīng)。

將剝離的兔坐骨神經(jīng)依次移入10%～30%蔗糖（0.1 mol/L PB配制）溶液梯度浸泡，標本下沉后進行冰凍切片，片厚12 μm，貼于載玻片上。切片先進行常規(guī)普魯士藍染色，從中選擇細胞形態(tài)較好的切片再進行抗S-100免疫組織化學(xué)法染色及DAB-H2O2棕色法染色。

1.4.4透射電鏡樣品制備 將移植端坐骨神經(jīng)切片，片厚50 μm，顯微鏡觀察后選取切片，用1%四氧化鋨固定30 min，50%～95%梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷置換，包埋及滲透，純包埋劑（Epon 812）浸透過夜，聚合（37℃ 12 h、45℃ 12 h、60℃ 12 h）。對含移植細胞的紋狀體區(qū)域在體視顯微鏡下進行超薄切片，片厚50 nm左右，由2%醋酸雙氧鈾（10 min）和枸櫞酸鉛（3 min）雙重染色后在電子顯微鏡下觀察，并進行拍照記錄。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件處理對照側(cè)、移植側(cè)各組織神經(jīng)纖維數(shù)量（各取6張切片，每張切片選8點統(tǒng)計纖維條數(shù)），計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，統(tǒng)計方法為配對t檢驗，α水平為0.05。

2觀察指標及結(jié)果

2.1染色觀察

通過HE染色對組織進行觀察，各只兔移植側(cè)與對照側(cè)神經(jīng)纖維均有不同程度再生，但對照側(cè)神經(jīng)纖維稀疏，較移植側(cè)神經(jīng)纖維數(shù)量明顯減少，切片見明顯的神經(jīng)不連續(xù)，基質(zhì)黏液變較移植側(cè)改變明顯（圖3）。移植側(cè)神經(jīng)纖維較對照側(cè)明顯增多，且排列較整齊。術(shù)后4周和8周，移植側(cè)形態(tài)上無顯著差別；移植后16周神經(jīng)纖維有序排列，S-100免疫組化染色可見施萬細胞核均勻分散在神經(jīng)纖維及神經(jīng)束之間（圖4）。移植治療側(cè)神經(jīng)纖維數(shù)量為2126.63±23.76，高于對照側(cè)的914.13±19.65，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=175.88，P<0.01）。

2.2透射電鏡檢查

透射電鏡下觀察，移植后8周內(nèi)在宿主坐骨神經(jīng)缺損處神經(jīng)樣細胞與移植細胞之間未觀察到有明顯突觸樣結(jié)構(gòu)，但移植16周標本可見移植細胞的突起伸向宿主施萬細胞突起或膠質(zhì)突起，兩者之間可見少量突觸形成（圖5）。

3討論

在臨床治療中，周圍神經(jīng)損傷是一類殘疾率高、治療困難的疾病[3]，臨床上再生修復(fù)效果常不理想[4-5]，這不僅給社會帶來沉重的負擔，同樣給家庭帶來了巨大痛苦。作為一種治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷的方法，細胞移植開辟了一條的新途徑[1，6-7]。2007年1月，Hu等[8]提取恒河猴自體BMSCs移植在尺神經(jīng)缺損處，并與自體神經(jīng)移植進行比較，結(jié)果顯示，BMSCs移植與自體神經(jīng)移植術(shù)后神經(jīng)恢復(fù)效果相當，這為BMSCs用來修復(fù)動物周圍神經(jīng)損傷提供了有力的證據(jù)。

BMSCs是成體干細胞，與其他干細胞相比有顯著優(yōu)越性[9]。由于BMSCs具有來源廣泛、強大的再生及分化潛能，且移植后體內(nèi)排斥反應(yīng)弱，并可以在誘導(dǎo)及相應(yīng)環(huán)境下分化出神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞等優(yōu)點[10-13]，因此，BMSCs移植治療神經(jīng)損傷一直是人們探索的目標。2006年6月，Hou等[14]先在體外將BMSCs誘導(dǎo)分化，然后將分化后的MSC插入導(dǎo)管中來橋接大鼠坐骨神經(jīng)損傷，手術(shù)后3個月顯示，移植組橋接管內(nèi)MSC在組織學(xué)上具有較完整的再生神經(jīng)結(jié)構(gòu)，復(fù)合肌動作電位（CMAP）的波幅、再生神經(jīng)組織百分比、有髓神經(jīng)纖維密度、軸突平均直徑、髓鞘厚度等參數(shù)均高于未移植BMSCs的對照組，并在神經(jīng)移植物遠端觀察到大量S100和NF陽性的神經(jīng)纖維。2013年9月，Salomone等[15]將誘導(dǎo)、培養(yǎng)的BMSCs移植到面神經(jīng)損傷的大鼠實驗?zāi)Ｐ?，在觀察12周后進行CMAP測量及組織學(xué)評價，結(jié)果顯示，移植組再生神經(jīng)的傳導(dǎo)速度有了明顯改善，CMAP波幅有了明顯升高；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量的再生軸突。經(jīng)過以上實驗研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs與周圍神經(jīng)有著及密切的關(guān)系[16-18]。

通過本實驗觀察到：①分離的BMSCs在體外培養(yǎng)3～4 d后能夠迅速貼壁生長，貼壁后細胞形態(tài)為有多個突觸的梭形或多角形，隨后細胞開始分裂增殖，表現(xiàn)出克隆生長的特性。通過傳代培養(yǎng)可去除非黏附細胞，這些細胞有可持續(xù)培養(yǎng)增殖的能力，提示BMSCs具有很強的再生能力。②在持續(xù)誘導(dǎo)、培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，分離、誘導(dǎo)的BMSCs可形成細胞克隆團，并逐漸出現(xiàn)出芽現(xiàn)象，由此形成細胞胞突，并彼此發(fā)生聯(lián)系，最終突起伸長連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈典型的神經(jīng)細胞形態(tài)。該結(jié)果提示BMSCs具有分化為組織細胞的潛能。③2014年，Mohammadi等[19]取大鼠的BMSCs進行體外培養(yǎng)、擴增并標記，移植入坐骨神經(jīng)損傷的大鼠模型中，對照組移植磷酸緩沖鹽水，手術(shù)后4、8、12周觀察大鼠行為及形態(tài)組織學(xué)，結(jié)果顯示，再生纖維的形態(tài)定量分析顯移植側(cè)的纖維數(shù)量和直徑均顯著高于對照組。本實驗也觀察到自體骨髓源性神經(jīng)干細胞移植兔坐骨神經(jīng)缺損有利于神經(jīng)纖維的修復(fù)，對照組比自體移植組神經(jīng)纖維生長有明顯差異，自體移植組明顯優(yōu)于對照組。

綜上所述，兔骨髓基質(zhì)源神經(jīng)干細胞移植后，可在自體坐骨神經(jīng)內(nèi)存活、遷移、分化，且無明顯排斥反應(yīng)。

[參考文獻]

[1]Kim HJ，Lee JH，Kim SH，et al.Therapeutic effects of human mesenchymal stem cells on traumatic brain injury in rats：secretion of neurotrophic afators and inhibition of apoptosis[J].J Neurotrauma，2010，27（l）：131-138.

[2]石更強，胡益.周圍神經(jīng)種子細胞的研究進展[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2015，32（2）：470-474.

[3]Torres RY，Miranda GE.Epidemiology of traumatic peripheral nerve injuries evaluated by electrodiagnostic studies in a tertiary care hospital clinic[J].Bol Asoc Med P R，2015， 107（3）：79-84.

[4]姚東東，張潔元，劉彬.周圍神經(jīng)損傷修復(fù)微環(huán)境的研究進展[J].中國修復(fù)重建外科雜志，2015，29（9）：1167-1170.

[5]H？觟ke A.Mechanisms of disease：what factors limit the success of peripheral nerve regeneration in humans[J].Nat Clin Pract Neurol，2006，2（8）：448-454.

[6]Wakao S，Matsuse D，Dezawa M.Mesenchymal stem cells as a source of Schwann cells：their anticipated use in peripheral nerve regeneration[J].Cell Tissues Organs，2014，200（1）：31-41.

[7]Mohammadi R，Mahmoodzadeh S.Combination of local transplantation of in vitro bone-marrow stromal cells and pulsed electromagnetic fields accelerate functional recovery of transected sciatic nerve regeneration：a novel approach in transected nerve repair[J].Curr Neurovasc Res，2015，12（3）：222-231.

[8]Hu J，Zhu QT，Liu XL，et al.Repair of extended peripheral nerve lesions in rhesus monkeys using acellular allogenic nerve grafts implanted with autologous mesenchymal stem cells[J].Exp Neurol，2007，204（2）：658-666.

[9]Gong Y，Wang H，Xia H.Stable transfection into rat bone marrow mesenchymal stem cells by lentivirus-mediated NT-3[J].Mol Med Rep，2015，11（1）：367-373.

[10]Freedman MS，Bar-Or A，Atkins HL，et al.The therapeutic potential of mesenchymal stem cell transplantation as a treatment for multiple sclerosis：consensus report of the International MSCT Study Group[J].Mult Scler，2010，16（4）：503-510.

[11]方波，馬虹.骨髓基質(zhì)干細胞移植治療脊髓損傷機制的研究進展[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（10）：985-989.

[12]Chopp M，Li Y.Treatment of neural injury with marrow stromal cells[J].Lancet Neurol，2002，1（2）：92-100.

[13]]Totey S，Totey S，Pal R，et al.Adult stem cells：a clinical update[J].Stem Cells，2009，4（2）：105-121.

[14]Hou SY，Zhang HY，Quan DP，et al.Tissue-engineered peripheral nerve grafting by diffentiated bone marrow stromal cells[J].Neuroscience，2006，140（1）：101-110.

[15]Salomone R，Bento RF，Costa HJ.Bone marrow stem cells in facial nerve regeneration from isolated stumps[J].Muscle Nerve，2013，48（3）：423-429.

[16]Schafer KH，Micci MA，Pasricha PJ.Neural stem cell transplantation in the enteric nervous system：roadmaps and roadblocks[J].Neurogastroenterol Motil，2009，21（2）：103-112.

[17]Osakada F，Hirami Y，Takahashi M.Stem cell biology and cell transplantation therapy in the retina[J].Biotechnol Genet Eng Rev，2010，26：297-334.

[18]Cunullings BJ，Tamaki SJ.Human neural stern cells differentiate and promote locomotor recover in spinal cord-injured mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（39）：1406-1407.

[19]Mohammadi R，Vahabzadeh B，Amini K.Sciatic nerve regeneration induced by transplantation of in vitro bone marrow stromal cells into an inside-out artery graft in rat[J].Craniomaxillofac Surg，2014，42（7）：1389-1396.

（收稿日期：2016-11-01 本文編輯：祁海文）