易禮俊，徐其銀，黃君

甲狀腺癌已成為我國發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一，屬于常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。依據(jù)甲狀腺癌的病理組織特征可分為濾泡狀甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀腺未分化癌、甲狀腺髓樣癌。乳頭狀甲狀腺癌占所有甲狀腺癌病理類型的90% 左右，且具有較高的復(fù)發(fā)率，造成不良預(yù)后。隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，以多種形式出現(xiàn)的中醫(yī)藥為甲狀腺癌的臨床診療提供了新的策略和方法，具有良好的應(yīng)用前景。

吳茱萸堿（Evodiamine），分子式為CHNO，是從蕓香科植物吳茱萸中提取出的一種吲哚喹唑啉生物堿，呈白色或淡黃色粉末。最近研究結(jié)果表明：吳茱萸堿具有抗腫瘤活性，對人乳腺癌細胞系MCF-7、卵巢癌細胞系A(chǔ)2780、結(jié)腸癌細胞系HCT-116、人胃癌細胞系SGC-7901、人胰腺癌細胞系SW1990、人膠質(zhì)瘤細胞系U251等多種腫瘤細胞系都具有抑制作用。吳茱萸堿對人甲狀腺癌是否也具有抑制作用，還值得進一步探究。本研究于2019年5—8月探討吳茱萸堿對甲狀腺癌細胞TPC-1 增殖和凋亡的影響，以期為臨床治療甲狀腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1

細胞與試劑 人甲狀腺癌TPC-1 細胞系，購自南京科佰生物科技有限公司；吳茱萸堿購自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自美國Gibco 公司；GoTaq? qPCR Master Mix購自美國Promega公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；RNAisoplus、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 均購自寶生物工程（大連）有限公司；噻唑藍（MTT）細胞增殖檢測試劑盒、存活蛋白兔單克隆抗體、胱天蛋白酶-3（caspase-3）兔單克隆抗體、叉頭框蛋白3（Foxp3）兔單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體均購自abcam 公司；其他的常規(guī)化學(xué)試劑均購自上海生工生物公司。

1.1.2

儀器 MCO-5AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本三洋；DFM-60 倒置熒光顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；SJ-CJ-1FD 超凈工作臺購自蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；ABI 7500 型定量PCR 儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 方法

1.2.1

細胞株及培養(yǎng) 將甲狀腺癌TPC-1 細胞系，接種于含10% 胎牛血清、鏈霉素（0.1 g/L）和青霉素（100 U/mL）的DMEM 培養(yǎng)液中，放置37 ℃、5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2

MTT 法檢測甲狀腺癌TPC-1 細胞的增殖取適宜細胞接種96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，分組處理（實驗組分別加入終濃度為1、3、6、8 μmol/L 的吳茱萸堿；對照組：不加任何藥物），每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別作用24、48、72 h，每孔加入MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加二甲基亞砜（DMSO），使結(jié)晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀于波長為490 nm 處檢測各孔吸光度，根據(jù)結(jié)果計算各組細胞存活率。存活率（%）=（實驗組吸光度－本底組吸光度）/（對照組吸光度－本底組吸光度）×100%

1.2.3

Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測凋亡率 取對數(shù)生長期的TPC-1 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h 后，分別加入0、1、3、6、8 μmol/L 的吳茱萸堿。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，制成單細胞懸液并計數(shù)。取10萬重懸的細胞，離心棄上清，加入195 μL Annexin VFITC 結(jié)合液輕輕重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫下避光孵育10 min。之后，1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細胞，再加入10 μL PI 染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。采用流式細胞儀檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.4

實時熒光定量PCR 檢測檢測存活蛋白、caspase-3 和Foxp3 的mRNA 表達 將對數(shù)生長期的TPC-1 細胞按5×10個/孔的密度均勻鋪在6 孔板中，加入不同濃度（0、3、8 μmol/L）吳茱萸堿細胞培養(yǎng)液作用48 h 后，用RNAisoplus 提取總RNA，再參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA），采用實時熒光定量PCR 檢測存活蛋白、caspase-3 和Foxp3 的表達情況，以GAPDH 和人內(nèi)源性微球蛋白（B2M）作為內(nèi)參。用Beacon Designer 8軟件設(shè)計特異性的熒光引物（見表1）。設(shè)置反應(yīng)體系，10 μL GoTaq? qPCR Master Mix、0.5 μmol/L 正向或反向引物、0.5 μL cDNA、用雙蒸水補足20 μL。設(shè)置反應(yīng)程序，95 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán)，95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，45個循環(huán)。每個樣品進行3 次重復(fù)，用無轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板和無模板作陰性對照。2的方法進行相對定量分析。

表1 用于RT-qPCR的引物

1.2.5

蛋白質(zhì)印跡法檢測存活蛋白、caspase-3 和Foxp3 的蛋白表達 將對數(shù)生長期的TPC-1 細胞按5×10個/孔的密度均勻鋪在6孔板中，加入不同濃度（0、3、8 μmol/L）吳茱萸堿細胞培養(yǎng)液作用48 h 后，以RIPA 裂解液在冰上裂解細胞10 min，12000 r/min 離心15 min（4 ℃），收集上清液，BCA 試劑盒測定樣品總蛋白含量。取30～40 μg樣品，進行10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），麗春紅染色（檢測電泳結(jié)果），轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃過夜，二抗恒溫搖床1 h，采用ECL 曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 對TPC-1 細胞增殖的抑制作用

MTT 檢測結(jié)果表明，吳茱萸堿對TPC-1 細胞的生長有明顯抑制作用，且隨藥物濃度和作用時間的增加而增強。見表2。

表2 不同濃度吳茱萸堿處理甲狀腺癌TPC-1細胞不同時間的細胞存活率比較/（%，±s）

2.2 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測凋亡率

經(jīng)過流式細胞儀的檢測，0（對照組）、1、3、6、8 μmol/L吳茱萸堿組細胞凋亡率分別為（5.61±0.83）%、（7.93±1.02）% 、（12.34±2.52）% 、（18.92±3.14）% 、（23.12±4.25）%。由此可知，與對照組相比，細胞凋亡率隨著吳茱萸堿濃度的升高而增加（

F

=22.564，

P

＜0.001；1、3、6、8 μmol/L 吳茱萸堿組分別與對照組相比，

t=

1.058、3.073、6.075、7.994，

P

=0.315、0.012、0.000、0.000）。

2.3 對TPC-1細胞存活蛋白、caspase-3和Foxp3的mRNA 表達的影響

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，吳茱萸堿作用TPC-1 細胞48 h 后，與對照組（1.00±0.05）相比，3 μmol/L 組（0.63±0.04）、8 μmol/L組（0.20±0.05）存活蛋白mRNA 的表達降低，吳茱萸堿可明顯下調(diào)TPC-1 細胞中存活蛋白的表達（

F

=232.005，

P

＜0.001）。與對照組（1.00±0.06）相比，3 μmol/L 組（1.68±0.06）、8 μmol/L 組（2.32±0.06）caspase-3 mRNA 的表達升高，吳茱萸堿可明顯上調(diào)TPC-1 細胞中caspase-3 的表達（

F

=376.945，

P

＜0.001）。 與對照組（1.00±0.03）相比，3 μmol/L 組（0.56±0.06）、8 μmol/L 組（0.12±0.03）Foxp3 mRNA的表達降低，吳茱萸堿可明顯下調(diào)TPC-1 細胞中Foxp3 的表達（

F

=384.445，

P

＜0.001）。因此，吳茱萸堿可明顯下調(diào)TPC-1細胞中MMP-2、Foxp3 mRNA表達，上調(diào)TPC-1細胞中caspase-3 mRNA表達。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

吳茱萸堿作用TPC-1細胞48 h 后，與對照組比較，吳茱萸堿組可明顯下調(diào)TPC-1 細胞中存活蛋白和Foxp3 蛋白表達，上調(diào)caspase-3蛋白表達，見圖1，表3。

圖1 各組甲狀腺癌TPC-1細胞的存活蛋白、caspase-3和Foxp3的蛋白表達

表3 不同濃度吳茱萸堿對甲狀腺癌TPC-1細胞存活蛋白、caspase-3和Foxp3蛋白表達的影響/±s

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿對眾多腫瘤細胞有較強的抗腫瘤活性，其機制涉及抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移、阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、促進自噬等。但其抗甲狀腺癌的活性及機制闡述還缺乏進一步的研究。

蘇文洲等研究表明吳茱萸堿可降低人骨肉瘤HOS 細胞的細胞活性，抑制其體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與其上調(diào)caspase-3 蛋白的表達、下調(diào)B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達有關(guān)。本研究中筆者采用MTT 法檢測細胞活性，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿能顯著抑制甲狀腺癌的增殖能力，且增殖抑制能力呈濃度和時間依賴性，8 μmol/L 吳茱萸堿作用72 h后，其抑制率可達98.15%，這與其它文獻報道的其作用于其他腫瘤的報道相一致。利用Annexin VFITC/PI雙染法檢測凋亡率，發(fā)現(xiàn)凋亡率隨著吳茱萸堿濃度的增加而逐漸增多。吳茱萸堿對甲狀腺癌細胞的凋亡誘導(dǎo)作用也與先前其作用與其他腫瘤的報道相一致。

存活蛋白是凋亡抑制蛋白家族的新成員，通過抑制caspase-3和胱天蛋白酶-7（caspase-7）阻斷細胞凋亡，參與促進細胞周期調(diào)控、細胞有絲分裂和血管生成等。caspase-3 是多種凋亡途徑最主要的下游效應(yīng)因子之一，是細胞凋亡的關(guān)鍵酶，在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用，直接參與細胞凋亡的發(fā)生。當?shù)蛲龃碳r，胞質(zhì)中的線粒體存活蛋白能迅速釋放，從而阻止caspases 活化，抑制細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，存活蛋白表達與caspase-3蛋白表達呈負相關(guān)。Shin 等認為，存活蛋白不是通過抑制起始caspase-8，而是通過結(jié)合并抑制caspase-3 和caspase-7 的活性來阻止細胞凋亡。呂琳娜等研究表明姜黃揮發(fā)油通過顯著上調(diào)caspase-3 的表達，下調(diào)存活蛋白的表達促進人皮膚鱗癌SCL-1細胞的體外凋亡。本研究結(jié)果表明吳茱萸堿通過下調(diào)存活蛋白和上調(diào)caspase-3 促進甲狀腺癌細胞凋亡，與上述結(jié)論一致。

另外，本研究也發(fā)現(xiàn)Foxp3 的表達水平下調(diào)。Foxp3 是叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個成員，在人體免疫系統(tǒng)發(fā)展和行使功能過程中發(fā)揮重要作用的。Foxp3 不但在Tregs 細胞表達，而且與Tregs 細胞的數(shù)量呈正相關(guān)。推測下調(diào)Foxp3 表達水平的可能是為了降低腫瘤微環(huán)境中Tregs 細胞數(shù)量，解除機體免疫抑制，增強抗腫瘤免疫功能。上述推測已在陸恬等的研究中得到證實。另外，也有研究表明FOXP3 是一種癌因子，在甲狀腺癌組織中的表達也明顯高于健康對照組，高Foxp3 表達組多表現(xiàn)為腫瘤直徑較大且多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率較低Foxp3 表達組高，沉默F(xiàn)OXP3 表達除了會抑制的腫瘤發(fā)生和發(fā)展，也會增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性。本研究的結(jié)果與其一致。

綜上所述，吳茱萸堿能夠抑制甲狀腺癌癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機制可能與其抑制存活蛋白、Foxp3，上調(diào)caspase-3的表達有關(guān)。