于夢(mèng)，宋欣麗，孫麗，梁芳，魯衛(wèi)星

研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方及中藥有效提取物，能有效地抑制氧自由基的形成，控制炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)損傷心肌的目的，在治療心肌缺血再灌注損傷中具有廣闊的應(yīng)用前景。大血藤是我國(guó)特有植物，又名紅藤、血藤，主要化學(xué)成分有酚酸類；藥理作用有鎮(zhèn)痛，消炎，抗腫瘤、抗氧化等。研究表明大血藤總酚酸可通過保護(hù)腦組織免受炎癥因子損傷，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡等減少腦缺血再灌注損傷，起到對(duì)腦組織的保護(hù)作用。大血藤總酚酸還通過抗氧化與改善腦組織能量代謝保護(hù)大鼠腦缺血再灌注損傷。且有研究發(fā)現(xiàn)大血藤多米糖具有抗心肌缺血的作用。然而大血藤總酚酸是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用及其機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道病毒性心肌炎患兒外周血中高表達(dá)的miR-155 能夠抑制Treg 免疫并加重心肌損傷。缺氧/復(fù)氧大鼠H9C2 心肌細(xì)胞中miR-155 高表達(dá)，下調(diào)miR-155 可促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺氧/復(fù)氧損傷。抑制miR-155 可通過有針對(duì)性地調(diào)節(jié)大鼠HIF-1α 來預(yù)防心肌缺血/再灌注損傷。表明抑制miR-155 具有保護(hù)心肌缺血/再灌注損傷的作用，因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究大血藤總酚酸是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制是否與miR-155有關(guān)，研究起止時(shí)間為2019年12月至2020年8月。

1 材料與方法

1.1 材料

心肌細(xì)胞H9C2（貨號(hào)6200，上海中喬新舟生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)A19008，上海傳秋生物科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（貨號(hào)Qiagen204143，北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒（貨號(hào)8028，上海美軒生物科技有限公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒（貨號(hào)K201-25，上海齊一生物科技有限公司）；RIPA 蛋白裂解液（貨號(hào)N653，上海恒渡生物科技有限公司）；肌酸激酶試劑盒（貨號(hào)1534651026）、LDH試劑盒（貨號(hào)1531916014）、丙二醛試劑盒（貨號(hào)1534619774）（上海江萊生物科技有限公司）。大血藤總酚酸由河南中醫(yī)學(xué)院化學(xué)室提供。

1.2 缺氧復(fù)氧模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞H9C2 接種于24 孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于含95% 氮?dú)夂?% 二氧化碳混合氣體的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后換成正常培養(yǎng)基在含95% 氮?dú)夂?% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將心肌細(xì)胞H9C2使用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為以下幾組：對(duì)照組：用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；缺氧/復(fù)氧組：缺氧4 h，復(fù)氧12 h，具體方法參考“1.2”；大血藤總酚酸低、中、高濃度組：造模前分別用12.5、25.0、50.0 mg/L 大血藤總酚酸培養(yǎng)2 h，然后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理；大血藤總酚酸-H+NC 組：將miR-155 模擬物陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至H9C2 中再用50.0 mg/L 大血藤總酚酸培養(yǎng)，最后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理；大血藤總酚酸-H+miR-155 mimic 組：將miR-155 模擬物轉(zhuǎn)染至H9C2中再用50.0 mg/L 大血藤總酚酸培養(yǎng)，最后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)miR-155表達(dá)水平

提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），按試劑盒說明進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量采用2法計(jì)算。miR-155 正向引物序列：5'-CTCTAATGGTGGCACAAA-3'，反向引物序列：5'-TGATAAAAACAAACATGGGCTTGAC-3'；U6 正向引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3'，反向引物序列：5'-AAAATATGGAACGCTTCACGA-3'。

1.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后每孔加20 μL 的MTT 溶液，培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液，加150 μL二甲基亞砜（DMSO），充分振蕩反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后用胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，洗滌細(xì)胞后分別加Annexin V-FITC 和PI各5 μL 混勻，常溫避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，定量后取適量蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入稀釋好的一抗，4 ℃孵育過夜，加入稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，化學(xué)發(fā)光試劑ECL 顯色，暗室下顯影、定影。Quantity-One分析蛋白條帶灰度值。蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，取心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒方法操作，用分光光度法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 大血藤總酚酸對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性及miR-155 表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞中miR-155 表達(dá)水平升高，細(xì)胞吸光度降低（

P

＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧組相比，大血藤總酚酸中、高濃度組miR-155表達(dá)水平降低，細(xì)胞吸光度升高，且呈濃度依賴性（

P

＜0.05），而大血藤總酚酸低濃度組miR-155 表達(dá)水平和細(xì)胞吸光度無明顯變化。見表1。

表1 大血藤總酚酸對(duì)細(xì)胞活性和miR-155表達(dá)的影響/±s

2.2 大血藤總酚酸對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞凋亡率升高，活化胱天蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）表達(dá)水平升高，胱天蛋白酶-3 前體（pro-caspase-3）表達(dá)水平降低（

P

＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧組相比，大血藤總酚酸中、高濃度組心肌細(xì)胞凋亡率降低，cleaved-caspase-3 表達(dá)水平降低，pro-caspase-3 表達(dá)水平升高，且呈濃度依賴性（

P

＜0.05），而大血藤總酚酸低濃度組細(xì)胞凋亡率和相關(guān)蛋白表達(dá)水平無明顯變化。見圖1、表2。

圖1 大血藤總酚酸對(duì)凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2 大血藤總酚酸對(duì)凋亡率和凋亡蛋白表達(dá)的影響/±s

2.3 大血藤總酚酸對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影響

與對(duì)照組相比，缺氧/復(fù)氧組心肌細(xì)胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量升高（

P

＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧組相比，大血藤總酚酸中、高濃度組心肌細(xì)胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量降低，且呈濃度依賴性（

P

＜0.05），而大血藤總酚酸低濃度組肌酸激酶、LDH、丙二醛含量無明顯變化。見表3。

表3 大血藤總酚酸對(duì)肌酸激酶、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛含量的影響/±s

2.4 過表達(dá)miR-155 對(duì)大血藤總酚酸處理的缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性及凋亡的影響

與大血藤總酚酸-H+NC 組相比，大血藤總酚酸-H+miR-155 mimic 組細(xì)胞吸光度降低，心肌細(xì)胞凋亡率升高，cleaved-caspase-3 表達(dá)水平升高，pro-caspase-3 表達(dá)水平降低（

P

＜0.05）。見圖2、表4。

表4 過表達(dá)miR-155可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對(duì)細(xì)胞活性和凋亡的影響/±s

圖2 過表達(dá)miR-155可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對(duì)凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.5 過表達(dá)miR-155 對(duì)大血藤總酚酸處理的缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影響

與大血藤總酚酸-H+NC組相比，大血藤總酚酸-H+miR-155 mimic 組肌酸激酶、LDH、丙二醛含量升高（

P

＜0.05）。見表5。

表5 過表達(dá)miR-155可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對(duì)肌酸激酶、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛含量的影響/±s

3 討論

心肌缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥因子等均與其相關(guān)。因此，探索如何減少心肌缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)細(xì)胞內(nèi)自由基大量產(chǎn)生，發(fā)生過氧化反應(yīng)；丙二醛是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，大量丙二醛可破壞細(xì)胞膜完整性，使細(xì)胞內(nèi)的乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶漏出細(xì)胞外；因此檢測(cè)肌酸激酶、LDH、丙二醛的含量可間接反應(yīng)細(xì)胞膜損傷程度。

研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷具有保護(hù)作用。研究報(bào)道大血藤不同極性部位對(duì)氧化應(yīng)激損傷成骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。且有研究報(bào)道雞血藤提取物可通過影響心肌組織中LDH、肌酸激酶、超氧化物歧化酶（SOD）的活性從而對(duì)豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)用缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞模擬心肌缺血再灌注，不同濃度的大血藤總酚酸處理后，結(jié)果顯示，中、高濃度處理組細(xì)胞吸光度升高，心肌細(xì)胞凋亡率降低，cleaved-caspase-3 表達(dá)水平降低，pro-caspase-3 表達(dá)水平升高，心肌細(xì)胞中肌酸激酶、LDH、丙二醛含量降低；表明中、高濃度的大血藤總酚酸可抑制心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。

研究報(bào)道m(xù)iR-155 可參與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)，如miR-155 的下調(diào)保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡。 銀耳銀耳多糖可通過抑制miR-155 減輕巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大血藤總酚酸中、高濃度處理后缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-155 表達(dá)水平降低；而過表達(dá)miR-155 可逆轉(zhuǎn)大血藤總酚酸對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性、凋亡和肌酸激酶、LDH、丙二醛含量的影響。提示，大血藤總酚酸可能通過調(diào)控miR-155影響缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷。

綜上所述，大血藤總酚酸可能通過下調(diào)miR-155抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的凋亡及氧化應(yīng)激。