張美珍 李登云 胡丹蘭

肺癌是臨床最為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高居所有腫瘤首位［1］。目前，肺癌的治療手段主要有手術(shù)切除、化學(xué)治療、免疫治療、放射治療等，但治療效果仍未達(dá)到理想狀態(tài)，且患者術(shù)后生存率較低［2］。紫杉醇是肺癌治療常見的有效藥，但易發(fā)生耐藥，且不良反應(yīng)多［3］。因而開展相關(guān)研究以尋求治療肺癌的有效藥或增強(qiáng)抗癌藥的抗腫瘤作用具有重要的意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn)大黃素能夠有效抑制多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展［4-6］。本文旨在觀察大黃素能否增強(qiáng)紫杉醇對肺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，為今后肺癌診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小細(xì)胞肺癌H466 細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司；大黃素購自東明格魯斯生物科技有限公司，紫杉醇購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)股份有限公司；青霉素、鏈霉素和胎牛血清均購自上海Sigma公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號：P0009）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8 試劑盒購自上海MedChem Express 公司；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）（批號：ab224077）、BCL2-Associated X 的蛋白質(zhì)（Bax）（批號：ab193573），及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號：ab181602）抗體均購自大連寶生物公司；Transwell 小室購自中國樂博生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)、用藥與分組：取小細(xì)胞肺癌H466 細(xì)胞株復(fù)蘇后，置入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，將對數(shù)生長期細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為（1×105個/mL）接種于96 孔板中，每孔加入100 μL，設(shè)置培養(yǎng)箱室溫條件為37 ℃、濕度條件為5% CO2，培養(yǎng)24 h。配制不同濃度的大黃素溶液［7］，0 μmol/、10 μmol/、50 μmol/、100μmol/L，設(shè)置5 組復(fù)孔，分為空白組（0 μmol/L 大黃素+0 μmol/L 紫杉醇）、大黃素組（10 μmol/L 大黃素+0μmol/L 紫杉醇）、紫杉醇組（0 μmol/L 大黃素+10 μmol/L 紫杉醇）、低劑量組（10 μmol/L 大黃素+10 mol/L 紫杉醇）、中劑量組（50 μmol/L 大黃素+10 μmol/L 紫杉醇）、高劑量組（100 μmol/L 大黃素+10 μmol/L 紫杉醇），每組設(shè)置8 個復(fù)孔。（2）2CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖：分別在加入大黃素和紫杉醇預(yù)處理培養(yǎng)48 h后，以換液形式加入比例為10 ∶1 的CCK-8 試劑，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，設(shè)置酶標(biāo)儀波長為450 nm，檢測各組OD 值，計算癌細(xì)胞增殖率細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/空白組OD 值）×100%。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：在加入大黃素和紫杉醇預(yù)處理培養(yǎng)48 h 后，收集懸浮及貼壁細(xì)胞，1000 r/min 離心5 min，加入膜聯(lián)蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞，避光室溫孵育10 min，離心，棄上清，碘化丙啶（PI）冰盒中避光孵育10 min，加400 μL 緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。（4）Transwell 法檢測細(xì)胞侵襲能力：在加入大黃素和紫杉醇預(yù)處理培養(yǎng)48 h 后，往Transwell 小室上層加入分別加入五組不同的培養(yǎng)細(xì)胞，下層加入500 μ含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，用棉簽輕輕拭掉膜上的細(xì)胞，利用0.5%的結(jié)晶紫對上室底部細(xì)胞進(jìn)行染色，并用棉簽除去上室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞并統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量。（5）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力：加入大黃素和紫杉醇預(yù)處理培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞，用10 μL 的槍頭在各組單層細(xì)胞上劃橫線，再用PBS 洗去因劃線而脫落的細(xì)胞，分別拍照并記錄0 h 和48 h 的細(xì)胞遷移情況，計算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率=（0 h 劃痕間隙距離-48 h 劃痕間隙距離）/0 h 劃痕間隙距離。（6）蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）檢測A549 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)：收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，Trizol 法提取細(xì)胞總蛋白，使用聚氰基丙烯酸正丁酯蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進(jìn)行定量測定，按比例加入4×蛋白上樣緩沖液，95 ℃ 變性 5 min，置于-20 ℃ 保存?zhèn)溆?。設(shè)置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為 120 V 進(jìn)行烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印。取氟乙烯膜用洗滌緩沖液洗膜5 min，共3 次，封閉、室溫?fù)u床孵育2 h。洗膜后先后加入一抗工作液（Bcl-2、Bax、GAPDH 抗體）和二抗工作液，進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育后，將新鮮配制的化學(xué)發(fā)光液滴加到氟乙烯膜表面，轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)暗箱中曝光，采集圖像并分析。蛋白定量以相對光密度值代表蛋白相對表達(dá)量，以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，方差齊的多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊采用Kruskal-wallis H 檢驗(yàn)，兩兩比較采用Tamhane's T2 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的細(xì)胞增殖抑制率比較 不同劑量大黃素聯(lián)合紫杉醇預(yù)處理48 h 后，空白組、大黃素組、紫杉醇組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞增殖抑制率分別（2.24±0.98）%、（6.43±1.21）%、（13.32±1.42）%、（23.91±4.50）%、（36.24±3.69）%和（57.37±9.52）%。與空白組比較，大黃素組、紫杉醇組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的細(xì)胞增殖抑制率均升（P＜0.05）；與大黃素組比較，紫杉醇組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的細(xì)胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；與紫杉醇組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；低劑量組、中劑量組和高劑量組比較，細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴式升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組的細(xì)胞凋亡率比較 不同劑量大黃素聯(lián)合紫杉醇預(yù)處理48 h 后，空白組、大黃素組、紫杉醇組、低劑量組、中劑量組和高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為（5.42±0.97）%、（7.94±1.23）%、（11.37±1.51）%、（16.82±1.67）%、（28.66±6.94）%和（35.54±6.98）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

2.3 各組A549 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平比較 見圖2、表1。

圖2 Westerblot檢測A549細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)結(jié)果

表1 各組A549細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組A549細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與大黃素組比較，#P＜0.05；與紫杉醇組比較，△P＜0.05；與低劑量組比較，▲P＜0.05；與中劑量組比較，□P＜0.05

組別nBcl-2Bax空白組81.63±0.210.34±0.12大黃素組81.35±0.19*0.54±0.13*紫杉醇組81.14±0.19*#0.80±0.16*#低劑量組80.92±0.15*#△1.02±0.21*#△中劑量組80.66±0.13*#△▲1.23±0.22*#△▲高劑量組80.46±0.15*#△▲□1.51±0.18*#△▲□F 值52.08149.878 P 值＜0.001＜0.001

2.4 各組的細(xì)胞遷移率比較 不同劑量大黃素聯(lián)合紫杉醇預(yù)處理48 h 后，空白組、大黃素組、紫杉醇組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的細(xì)胞遷移率分別（36.35±1.12）%、（29.37±3.69）%、（20.54±1.94）%、（13.36±1.81）%、（7.75±2.66）%和（3.57±1.07）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 各組的侵襲細(xì)胞數(shù)比較 不同劑量大黃素聯(lián)合紫杉醇預(yù)處理48 h 后，空白組、大黃素組、紫杉醇組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別（89.50±8.47）個、（88.50±7.78）個、（84.63±10.08）個、（61.50±6.48）個、（54.1±6.36）個和（15.88±3.80）個，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各組侵襲細(xì)胞數(shù)（結(jié)晶紫染色×200）

3 討論

肺癌按細(xì)胞類型可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌（SCLC）兩大類型。SCLC 是起源于支氣管黏膜或腺體的一類肺惡性腫瘤，占全部原發(fā)性肺癌的14.18%［8］，相較于非小細(xì)胞肺癌，SCLC 的惡性程度較高，生長速度迅速，倍增時間較短，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且初期癥狀不明顯，確診時多已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶。目前，SCLC 除采用以化療為主的綜合治療外，尚未找出理想的治療方法。紫杉醇是廣譜抗癌藥物，適用于多種腫瘤疾病的治療，然而長期使用會增加心血管毒性、肝臟毒性、脫發(fā)等不良反應(yīng)的發(fā)生率，甚至?xí)霈F(xiàn)支氣管痙攣性呼吸困難、蕁麻疹和低血壓現(xiàn)象，其中過敏反應(yīng)發(fā)生率較高［9］。大黃素的化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，是掌葉大黃根莖中重要活性成分，能夠誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激依賴性凋亡［10］，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和Tribbles 同源物3/核轉(zhuǎn)錄因子途徑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡［11］，通過Wnt/β-Catenin 途徑抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和遷移［12］。

本研究結(jié)果顯示，大黃素組和紫杉醇組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于空白組，且紫杉醇組高于大黃素組，說明大黃素和紫杉醇兩種藥物均有抑制癌細(xì)胞增殖的作用，紫杉醇效果更明顯。另一方面，大黃素組與低劑量組設(shè)置的大黃素預(yù)處理濃度相同，多加紫杉醇的低劑量組的細(xì)胞增殖抑制率增大，提示大黃素與紫杉醇聯(lián)用更能抑制癌細(xì)胞增殖，紫杉醇組與低、中、高各劑量組比較，由于各組設(shè)置的大黃素預(yù)處理濃度不一致，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴式升高，結(jié)果表明大黃素能增強(qiáng)紫杉醇抑制癌細(xì)胞增殖的能力，且大黃素濃度越高效果越明顯。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組的細(xì)胞凋亡情況及WB 檢測細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，各組的細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)趨勢與細(xì)胞增殖抑制率一致，Bcl-2 蛋白表達(dá)趨勢與細(xì)胞增殖抑制率完全相反，Bcl-2 蛋白抑制癌細(xì)胞凋亡，而Bax 蛋白與Bcl-2 蛋白拮抗起到促進(jìn)作用，因此兩種檢測方法均能反映細(xì)胞凋亡情況。研究顯示，大黃素能增強(qiáng)紫杉醇促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用，且大黃素濃度越高效果越明顯。進(jìn)一步檢測細(xì)胞遷移能力發(fā)現(xiàn)，大黃素和紫杉醇均能抑制癌細(xì)胞遷移，紫杉醇效果比大黃素明顯，聯(lián)用效果更明顯，亦有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果提示大黃素能增強(qiáng)紫杉醇抑制細(xì)胞遷移的作用，且大黃素濃度越高效果越明顯。觀察各組癌細(xì)胞侵襲個數(shù)，空白組、大黃素組和紫杉醇組的癌細(xì)胞侵襲數(shù)無明顯差異，與上述3 組比較，低、中、高各劑量組的癌細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低，且高劑量組低于低劑量和中劑量組，說明聯(lián)用大黃素和紫杉醇能夠降低癌細(xì)胞的侵襲能力，高劑量組更為明顯。

綜上，大黃素和紫杉醇均能抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)人肺癌A549 細(xì)胞凋亡，大黃素能夠增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤作用，抑制腫瘤效果與大黃素劑量密切相關(guān)。