邵哲成 范軍軍 王泳超

隨著肺癌驅(qū)動基因研究的深入，分子靶向治療取得飛躍發(fā)展。免疫治療是近幾年發(fā)展起來的另外一種治療手段，特別是對基于免疫檢查點抑制劑基礎(chǔ)上的PD-1/PD-L1 治療使部分驅(qū)動基因陰性患者的生存期顯著提高［1-3］。多種PD-1 和PD-L1 抗體已被FDA 批準(zhǔn)用于EGFR/ALK 驅(qū)動基因陰性晚期非小細(xì)胞肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。然而，并非所有肺癌患者均能從抗PD-1/PD-L1 抗體免疫治療中獲益，非小細(xì)胞肺癌及小細(xì)胞肺癌二線治療的有效率均低于20%，顯然不符合當(dāng)前精準(zhǔn)治療的標(biāo)準(zhǔn)，因此如何提高免疫治療的有效率是當(dāng)前研究的熱點問題［4-5］。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）是脫離了腫瘤原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位而進(jìn)入血液循環(huán)中的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱。由于腫瘤本身具有的異質(zhì)性，釋放到體液中的CTC 往往能夠代表腫瘤更強侵襲狀態(tài)以及更多惡性轉(zhuǎn)化的相關(guān)信息［6］。本文旨在探究小細(xì)胞肺癌患者活檢組織與CTC 中PD-L1 的表達(dá)差異以及與免疫療法的相關(guān)性，為臨床診療提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016 年1 月至2018 年6 月于本院就診治療的廣泛期小細(xì)胞肺癌患者作為研究對象。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲；組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為小細(xì)胞肺癌，根據(jù)美國退伍軍人肺癌協(xié)會（VALG）分期為廣泛期；存在不超過1 年的治療前腫瘤組織塊；具有經(jīng)CT 或MRI 檢查可測量的病變。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：美國東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）體力狀況評分＞2 分；存在免疫治療禁忌癥；人類免疫缺陷病毒或乙肝病毒感染者；患有≥2 級周圍神經(jīng)病變；存在藥物過敏或不良反應(yīng)者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 組織學(xué)分析 在對CTCs 分析結(jié)果不知情的前提下，采用免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry staining，IHC）評價肺癌組織內(nèi)的PD-L1 表達(dá)，使用抗PD-L1 兔單克隆抗體（克隆E1L3N，細(xì)胞信號技術(shù)公司）。

1.3 CTCs分析 組織活檢與治療前的血液樣本采集時間間隔平均（7.5±1.2）個月，8 例（23.3%）患者的時間間隔短于1 個月，21 例（70.0%）為1～12 個月，2例（6.7%）超過1 年。采集血液樣本5 mL，2 h 內(nèi)采用上皮腫瘤細(xì)胞大小分離法（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）獲取CTC。滿足以下標(biāo)準(zhǔn)其中4 項及以上的細(xì)胞認(rèn)定為CTC［7］：①細(xì)胞核明顯增大；②核質(zhì)比＞0.8；③色素增加和染色不均勻；④核膜不規(guī)則；⑤各向異性（比率＞0.5）；⑥存在核染色質(zhì)側(cè)移或大核仁；⑦有絲分裂異常。無細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞不予以分析。在對組織學(xué)分析結(jié)果不知情的前提下，使用兔mAb（克隆D8T4X，Cell Signaling Technology）和CD45（克隆MEM-28，Abcam）對每位患者的五個點（每個點1 mL血液樣本）進(jìn)行PD-L1 免疫熒光染色。使用10%（v/v）AB 血清（Bio-Rad）進(jìn)行非特異性結(jié)合阻斷，隨后將細(xì)胞與抗PD-L1-抗體（兔單克隆抗體，稀釋度1 ∶200）在室溫下孵育45 min，為了在血細(xì)胞背景中鑒定出加標(biāo)的腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞與抗CD45 抗體（REA747 mAb，MACS Miltenyi Biotec，稀釋度1 ∶200）在室溫下放置45 min，使用DAPI（Carl Roth，稀釋度1 ∶1000）對細(xì)胞核染色。連接至AxioCam 相機（卡爾·蔡司），通過Axioplan 2 成像顯微鏡評估熒光結(jié)果，曝光1.6 s 后，評價CTC 的PD-L1 特異性免疫熒光，分為陰性（0）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強陽性（+++）。CTC 被定義為DAPI + / CD45-細(xì)胞且具有惡性細(xì)胞形態(tài)特征，例如大小、形狀、單核、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比率等，見圖1。

圖1 CTC上PD-L1顯示

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以［n（%）］表示，采用卡方檢驗和Fisher 精確檢驗；計量資料以中位數(shù)及范圍，使用Kruskal-Wallis 檢驗進(jìn)行評估。采用Spearman 系數(shù)計算相關(guān)性；自免疫治療起始計算生存時間且通過Kaplan-Meier 方法進(jìn)行評估；單變量分析計數(shù)變量采用時序檢驗，連續(xù)變量則采用Cox 比例風(fēng)險模型。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床與病理特征 納入研究患者共30 例，確診時年齡35～78 歲，平均（60.6±1.5）歲；男19例（63.3%），女11 例（36.7%）；腺癌22 例（73.3%），鱗癌7 例（23.3%），肉瘤樣癌1 例（3.3%）；基因分型，EGFR 2 例（6.7%），KRAS13 例（43.3%），ALK 1例（3.3%），MET 1 例（3.3%），未進(jìn)行基因檢測13 例（43.3%）；既往治療，化療28 例（92.7%），靶向治療5例（16.7），胸部放療4 例（13.3%）；免疫檢查點抑制劑治療采用納武單抗（Opdivo 奧德武，百時美施貴寶，50 mg/10 mL），每2 周歷時60 min 靜脈輸注給予3 mg/kg；治療進(jìn)展中30 例，28 例既往接受化療但療效不佳。

2.2 CTCs 上PD-L1 表達(dá)及與組織學(xué)相關(guān)性 30 例患者均獲得可匹配的組織，組織中PD-L1 染色見于14 例患者，占比46.7%；27 例患者的組織獲得具體技術(shù)可知，70.4%的病例采用小活檢組織樣本的PD-L1 分析，其中63.0%經(jīng)支氣管鏡檢查獲得，7.4%經(jīng)CT 引導(dǎo)下活檢獲得，29.6%于手術(shù)切除標(biāo)本時進(jìn)行。

基線水平93.3%（28/30）樣本中檢測到CTCs，基線時每7.5 mL 樣本中CTCs 數(shù)量為3～228，平均32。CTCs表達(dá)PD-L1 的比例為0%～100%，平均為17.5%。87%的患者至少在1%的CTCs 上表達(dá)了PD-L1。見圖2。

圖2 基線水平活檢組織及CTCs上PD-L1的表達(dá)

治療前，活檢組織及CTCs 中PD-L1 表達(dá)之間無顯著相關(guān)性（r=0.05，P=0.82），兩者的吻合率為46.7%（14/30），剩余16 例不一致的病例中，13 例CTCs 中陽性而活檢組織中表達(dá)陰性，3 例則僅表現(xiàn)為組織上的陽性，14 例吻合的病例中4 例均為陰性，10 例均為陽性。

2.3 PD-L1 表達(dá)與免疫抑制劑治療反應(yīng)的相關(guān)性 選擇基線水平的平均CTCs 作為截止值（32/7.5 mL），結(jié)果顯示與低CTCs 負(fù)荷相比，高CTCs 計數(shù)患者的臨床預(yù)后更差，無進(jìn)展生存率（PFS）：HR 2.52［1.48～4.12］，P=0.0003；總生存率（OS）：HR 2.48［1.28～4.74］，P=0.0052），見圖3A 和3B。PD-L1 + CTCs 的存在與否對PFS 無明顯影響（閾值≥1%：HR 1.25［0.68～2.33］，P=0.59；閾值≥5%：HR 1.09［0.63～1.92］，P=0.92；閾值≥10%：HR 0.78［0.48～1.29］，P=0.28），或OS（ 閾值≥1%：HR 1.08［0.49～2.52］，P=0.92；閾值≥5%：HR 1.41［0.62～3.22］，P=0.47；閾值≥10%：HR 0.96［0.52～1.92］，P=0.90），見圖3C 和3D。免疫抑制劑反應(yīng)者（PFS＞6 個月）基線水平的CTC 計數(shù)偏低（23.6VS.48.8，P=0.014），與CTCs PD-L1 陰性的患者比較，基線時PD-L1 + CTCs（≥1%）的患者更多表現(xiàn)為無反應(yīng)［20/30（66.7%）VS.5/13（38.5%），P=0.02］，見圖4。活檢組織中PD-L1 的表達(dá)與臨床結(jié)局無關(guān)（≥1%：HR 0.66，P=0.25；≥5%：HR 0.84，P=0.52；≥50%：HR 0.79，對于PFS，P=0.63）。

圖3 CTC負(fù)荷及是否存在PD-L1+CTCs對患者OS和PFS的影響

圖4 基線時PD-L1 + CTCs數(shù)量與免疫抑制劑反應(yīng)關(guān)系

2.4 進(jìn)展中的PD-L1 + CTC 30 例患者中可獲得進(jìn)展中的樣本，29 例存在CTCs。與治療前（32/7.5 mL）比較，進(jìn)展中的CTCs 計數(shù)更高（53.6/7.5 mL，P=0.012）。所有患者存在PD-L1 + CTC（29/29），其中82.8%（24/29）的CTCs 上PD-L1 染色超過10%（治療前為67%），見圖2。

3 討論

本研究證實，晚期非小細(xì)胞肺癌患者通過CTCs 無創(chuàng)進(jìn)行PD-L1 表達(dá)分析的可行性。PD-L1 在CTCs 上的表達(dá)可見于93.3%的病例中，在活檢組織中的表達(dá)為46.7%，可能與獲得的樣本量較少相關(guān)，因為在完成診斷步驟后剩余的組織樣本量通常很少，關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的研究，采用了不同的裝置對此方法進(jìn)行報道［8-11］。使用納武單抗治療期間，基于上皮標(biāo)記物表達(dá)技術(shù)對CTCs進(jìn)行監(jiān)測顯示在基線水平時PD-L1 + CTCs的發(fā)生率為100%，另一組未經(jīng)ICI治療的患者其循環(huán)免疫或腫瘤細(xì)胞中PD-L1 的表達(dá)與臨床預(yù)后不良相關(guān)［12］。然而，循環(huán)中PD-L1 染色的免疫細(xì)胞的具體影響仍不明確［13-16］，因為其不一定來自于腫瘤微環(huán)境。QIU 等［17］首次報道使用ISET 平臺與匹配組織的一致性，但PD-L1 是通過Ventana SP142 抗體的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行操作的，染色的腫瘤細(xì)胞較少，相應(yīng)的PD-L1 染色率較低，CTCs 上為8%（6/71），活檢組織上為15%（11/71）。因此，若要在臨床實踐中應(yīng)用血液樣本對PD-L1 腫瘤表達(dá)進(jìn)行檢測，需要對檢測步驟進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比如使用活檢組織的程序。除了兩種方法使用不同的抗體外，活檢組織與血液樣本的結(jié)果缺乏相關(guān)性，與部分文獻(xiàn)報道一致［18］，考慮原因有以下幾點：①采樣時間間隔差異，本研究使用的是檔案組織，活檢與采集血液樣本的時間間隔平均為7.5 個月，僅8 例患者在1 個月內(nèi)完成兩項檢查；②腫瘤位置異質(zhì)性，是組織學(xué)檢查的主要局限之一［19-20］。與手術(shù)切除的標(biāo)本相比，組織活檢可能低估了PD-L1 陽性腫瘤的發(fā)現(xiàn)率，本研究顯示CTCs 中檢測陽性的患者比例較高，與其他研究使用手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行觀察的結(jié)果相一致［21］。

生存率分析證實，CTC 負(fù)荷對接受ICI 治療患者臨床預(yù)后的預(yù)測價值，與文獻(xiàn)中的觀點相一致，即PD-L1的表達(dá)不利于患者的生存率［22］。還有研究認(rèn)為，依賴于CTCs 的不利影響，無論PD-L1 的表達(dá)如何，腫瘤的轉(zhuǎn)移幾率和范圍仍較大。CTCs 的大量存在可能增加PD-L1 + CTC 發(fā)現(xiàn)的可能性，然而根據(jù)CTC 負(fù)荷的亞組分析顯示結(jié)果并未發(fā)生變化，那么臨床結(jié)局的差異可能與PD-L1 + CTC 的整體預(yù)后影響相關(guān)，而非僅取決于細(xì)胞對納武單抗治療反應(yīng)的影響。MIGNON 等［23］報道了5/10 例患者在半年內(nèi)PD-L1 + CTC 的持續(xù)存在與疾病進(jìn)展有關(guān)。本組所有病情進(jìn)展的患者均檢測到PDL1 + CTC，提示該細(xì)胞群存在獲得性ICI 抵抗。PD-L1+ CTC 的高發(fā)生率與相應(yīng)活檢組織的不一致提示兩者之間存在互補。

綜上所述，對CTCs 進(jìn)行PD-L1 分析是完全可行的，并且CTCs 的陽性率通常高于活檢組織中的陽性率。免疫抑制治療中基線時PD-L1 + CTCs（≥1%）的患者更多表現(xiàn)為無反應(yīng)，治療前高CTCs 負(fù)荷與臨床預(yù)后不良有關(guān)，但CTCs 上PD-L1 的表達(dá)與否對預(yù)后無顯著影響。需要進(jìn)一步的研究來評估液體活檢在免疫腫瘤學(xué)中的作用，包括其他循環(huán)標(biāo)志物等。本研究尚存在一定的局限性，由于是單中心小樣本研究，在患者和研究方法的選擇上可能存在偏倚；另外，因為晚期肺癌患者發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的CTCs 數(shù)量遠(yuǎn)高于上皮型，所以有必要針對CTCs 的分型展開分析以強化研究結(jié)果；本研究納入的患者有92.7%既往接受過化療，因此屬于二線及以上的治療，患者的療效及臨床預(yù)后通常不佳，下一步需要深入探究CTCs中PD-L1表達(dá)對免疫檢查點抑制劑結(jié)合一線化療的指導(dǎo)價值，將有益于患者的生存預(yù)后。