孫曼曼，高文濤，石冰濤

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室， 鄭州 451191)

弱視的發(fā)病機(jī)制目前還不太明確。很多研究[6-8]報(bào)告指出，可能與下列分子表達(dá)的變化相關(guān)：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)等神經(jīng)生長(zhǎng)因子、促生長(zhǎng)因子(IGF)和其家族成員[9-10]、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bax 及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)等凋亡、抗凋亡相關(guān)的分子[11-12]眼優(yōu)勢(shì)柱出現(xiàn)偏移在單眼形覺(jué)剝奪中依賴三種激酶：Ca2+/鈣調(diào)素依賴性、蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、依賴環(huán)磷酸腺苷的蛋白激酶A(PKA)等[13-14]。此外與在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期視覺(jué)傳導(dǎo)系統(tǒng)視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體、視皮質(zhì)等部位神經(jīng)元突觸可塑性的變化[15-17]、樹突棘的丟失[18]等變化有關(guān)。

瞬時(shí)受體蛋白香草酸亞型3(transient receptor potential vanilloid 3，TRPV3)屬于TRP離子通道家族，屬于非選擇性陽(yáng)離子通道，主要對(duì)鈣離子有通透性，廣泛表達(dá)于皮膚、舌、脊髓、腦等部位。其表達(dá)可以受很多因素的影響與調(diào)節(jié)，如溫度、滲透壓、pH值、機(jī)械力以及一些內(nèi)外源性配體和細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)分子。目前發(fā)現(xiàn)在介導(dǎo)感覺(jué)信號(hào)的傳遞、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等中有重要作用。而目前關(guān)于TRPV3在視覺(jué)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的表達(dá)及作用，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立形覺(jué)剝奪性弱視大鼠模型，利用免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)免疫印跡(western-blot，WB)技術(shù)來(lái)研究剝奪性弱視大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞TRPV3蛋白的變化規(guī)律，探討其在弱視發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 生后2周齡SD大鼠36只(體質(zhì)量無(wú)要求)，雌雄不限，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組，經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物是由河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供并在其寄養(yǎng)，動(dòng)物房的相對(duì)濕度控制在40%～50%，溫度保持在20～24 ℃，12 h晝夜節(jié)律(光照時(shí)間8:00-20:00)自由飲水和進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料，實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照國(guó)家研究院批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用健康指南。主要試劑：兔抗大鼠TRPV3抗體(由Alomone提供)、生物素化廣譜IgGPAN和三抗ABCkit(由Vector lab提供)、DAB顯色試劑盒(由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供)、熒光驢抗兔IgG488(Jackson)Anti-GAPDH、HRP-conjugated anti-rabbit、HRP-conjugated anti-mouse(由碧云天提供)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)組大鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%水合氯醛0.2～0.3 mL，全身麻醉固定，剪除眼周多余毛發(fā)，碘附消毒眼周，剪除左眼上下瞼緣1.0～2.0 mm，縫合眼瞼，術(shù)后1周每日抗生素眼液滴眼。術(shù)后每日檢查縫線是否脫落，如有脫落則棄之不用。

1.2.1.2 灌注固定和取材 4周后進(jìn)行灌注固定和取材，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%水合氯醛全身麻醉后開胸，充分暴露心臟，將灌注頭由心尖處插入左心室并送入主動(dòng)脈內(nèi)，剪開右心耳?？焖俟嘧⒘姿峋彌_鹽溶液(PBS) 300 mL，再灌注體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液200 mL，先快后慢。灌注完成后取雙側(cè)眼球。標(biāo)本分為正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，正常對(duì)照組剝奪側(cè)眼，實(shí)驗(yàn)組未剝奪側(cè)眼，將取出的眼球剪除，角膜和晶體，后浸入體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液(40 g PFA/1 000 mL)中4 ℃過(guò)夜，梯度沉糖(15%蔗糖、30%蔗糖)，包埋，然后迅速放入-80 ℃冰凍保存。恒冷冰凍切片機(jī)調(diào)至-25 ℃，切片厚度調(diào)至10 μm，進(jìn)行連續(xù)眼球切片。蘇木精-伊紅染色(HE染色)：將切好的片子在蒸餾水中洗滌2 min，蘇木素染色液染色1 min，浸自來(lái)水中沖洗去多余的染色液，蒸餾水再洗滌一遍(數(shù)秒鐘)。伊紅染色液染色1～2 min，脫水、透明、封片。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 室溫下孵育盒里孵育質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%醫(yī)用過(guò)氧化氫(H2O2) 30 min，室溫下孵育盒里孵育體積分?jǐn)?shù)10%馬血清封閉2 h，1∶100的比例加入兔抗TRPV3(陰性對(duì)照組以1∶1的比例加入內(nèi)源性抗原肽和一抗混合物)，1∶400的比例加入生物素標(biāo)記的抗兔的二抗， 1∶400比例加入ABC復(fù)合物(A、B液應(yīng)提前30 min配置混勻)，DAB顯色，晾干。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片晾干，在光鏡顯微鏡下閱片、拍照。

1.2.3 免疫熒光染色 將室溫下孵育盒里孵育質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%H2O230 min，室溫下孵育盒里孵育體積分?jǐn)?shù)10%馬血清封閉2 h， 1∶100的比例加入兔抗TRPV3， 1∶300的比例加入熒光二抗，避光下加入DAPI，在熒光顯微鏡下閱片、拍照。

需求分析的缺失還表現(xiàn)在教材質(zhì)量參差不齊。目前我國(guó)圖書市場(chǎng)上不乏各種專業(yè)ESP教材，但這些教材在內(nèi)容的系統(tǒng)性和時(shí)效性上不突出，表現(xiàn)為缺乏真實(shí)場(chǎng)景的語(yǔ)言訓(xùn)練，不利于學(xué)習(xí)者語(yǔ)用能力的發(fā)展。以商務(wù)英語(yǔ)教材為例，在教材中沒(méi)有對(duì)語(yǔ)言輸出和與專業(yè)結(jié)合的交際能力的訓(xùn)練，直接影響學(xué)生語(yǔ)用能力的培養(yǎng)和教學(xué)效果。再看科技英語(yǔ)教材，文章加練習(xí)的傳統(tǒng)精讀教材的編排格式，體現(xiàn)科技英語(yǔ)的地方就是文章是科普類文章。人的認(rèn)知能力和語(yǔ)言能力應(yīng)互為促進(jìn)，學(xué)習(xí)者專業(yè)語(yǔ)言能力應(yīng)通過(guò)教材的學(xué)習(xí)得到發(fā)展。ESP教材單薄的設(shè)計(jì)沒(méi)有體現(xiàn)專業(yè)英語(yǔ)的語(yǔ)用功能，也不能滿足學(xué)生對(duì)科技英語(yǔ)學(xué)習(xí)的要求。

1.2.4 WB實(shí)驗(yàn) 變性蛋白跑膠1.0～1.5 h，110 V，后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，2.5 h，60 V。10%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，以1∶200的比例加入兔抗TRPV3(內(nèi)參條帶加入1∶2 000的鼠抗GAPDH)，以1∶2 000的比例加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔的二抗(內(nèi)參條帶加入抗鼠二抗)，暗室進(jìn)行顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜HE染色 實(shí)驗(yàn)組縫合側(cè)眼視網(wǎng)膜HE染色與對(duì)側(cè)(未縫合)比較：細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)更紊亂，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目變少，細(xì)胞核染色更深(圖1A、B)。提示單眼形覺(jué)剝奪性弱視大鼠視網(wǎng)膜存在細(xì)胞損傷或者細(xì)胞數(shù)目的減少。

圖A 實(shí)驗(yàn)組形覺(jué)未剝奪側(cè)視網(wǎng)膜HE染色(nondeprived eyes,ND)；圖B 實(shí)驗(yàn)組形覺(jué)剝奪側(cè)視網(wǎng)膜HE染色(monoculardeprived eyes ,MD)；箭頭指示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。

2.2 免疫組織化學(xué) 光學(xué)顯微鏡下，大鼠視網(wǎng)膜陽(yáng)性細(xì)胞胞膜呈棕褐色，胞漿著色較淺或不著色(圖2 A、B、C)，陰性對(duì)照未見特異性染色(圖2D)，實(shí)驗(yàn)組視覺(jué)剝奪眼陽(yáng)性細(xì)胞染色較淡，平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼和正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2E)。

2.3 免疫熒光 熒光顯微鏡下，大鼠視網(wǎng)膜陽(yáng)性細(xì)胞胞膜顯示綠色熒光，細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光。(圖3 A、B、C)

圖A正常對(duì)照組;圖B實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼視網(wǎng)膜(ND);圖C實(shí)驗(yàn)組形覺(jué)剝奪眼視網(wǎng)膜(MD);圖D陰性對(duì)照組。箭頭指示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性細(xì)胞。INL:內(nèi)核層，ONL:外核層。圖E為統(tǒng)計(jì)圖:實(shí)驗(yàn)組剝奪眼視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞與對(duì)側(cè)眼視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞和正常對(duì)照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞比較，TRPV3蛋白的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 實(shí)驗(yàn)組未剝奪側(cè)眼視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞與正常對(duì)照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞比較，TRPV3蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖A正常對(duì)照組；圖B實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼視網(wǎng)膜；圖C實(shí)驗(yàn)組形覺(jué)剝奪眼視網(wǎng)膜。箭頭指示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。

2.4 WB 將正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜蛋白提取出來(lái)進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果表明，TRPV3分子免疫印跡陽(yáng)性條帶出現(xiàn)位置與抗體說(shuō)明書上提供的陽(yáng)性參考條帶所在位置一致。與實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼和正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組視覺(jué)剝奪眼的陽(yáng)性條帶明顯變窄(圖4 A)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,實(shí)驗(yàn)組視覺(jué)剝奪眼與實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼和正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4 B)。

圖4 SD大鼠視網(wǎng)膜TRPV3蛋白WB顯影表達(dá)變化

3 討論

目前,對(duì)于弱視病因和發(fā)病機(jī)理研究的認(rèn)識(shí)，主要來(lái)自動(dòng)物模型組織學(xué)和生理學(xué)的研究觀察或?qū)純号R床觀察及電生理功能異常的檢測(cè),弱視模型可以在視覺(jué)發(fā)育敏感期高峰由縫合單眼眼瞼所誘導(dǎo)形成[19-20]。但由于各種外在因素的影響,其研究結(jié)果可能存在異議。但是普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，弱視是一種從視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞至視中樞的整個(gè)視覺(jué)傳導(dǎo)系統(tǒng)的功能及形態(tài)學(xué)異常引起的臨床癥候群。

本實(shí)驗(yàn)觀察到TRPV3蛋白存在于視網(wǎng)膜這一高度特化的組織結(jié)構(gòu)內(nèi),主要定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞胞膜內(nèi)。視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期大鼠一側(cè)眼持續(xù)4周在黑暗條件下與對(duì)側(cè)眼及正常對(duì)照組比較,圖A為TRPV3在SD大鼠視網(wǎng)膜的WB條帶，nor為正常對(duì)照組，ND為實(shí)驗(yàn)組未剝奪眼，MD為實(shí)驗(yàn)組形覺(jué)剝奪眼。圖B為統(tǒng)計(jì)圖。實(shí)驗(yàn)組剝奪眼視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞與對(duì)側(cè)眼視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞和正常對(duì)照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞比較，TRPV3蛋白的表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而實(shí)驗(yàn)組未剝奪側(cè)眼視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞與正常對(duì)照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞比較，TRPV3蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

其視網(wǎng)膜中TRPV3蛋白表達(dá)明顯減少，而視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期結(jié)束后的大鼠一側(cè)眼視覺(jué)剝奪4周與對(duì)側(cè)眼比較，視網(wǎng)膜中TRPV3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。由此提示,TRPV3蛋白可能參與視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)的視覺(jué)發(fā)生發(fā)展等視覺(jué)過(guò)程。TRPV3蛋白表達(dá)減少可能是由于在黑暗環(huán)境中,視覺(jué)信息減少而使TRPV3蛋白表達(dá)受到抑制所致。

TRPV3最初研究[21-23]發(fā)現(xiàn)扮演著溫度感受器的功能，在一定溫度(31～39 ℃)下被激活。TRPV3的激活可以使胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子濃度增高，鈣離子是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，參與細(xì)胞內(nèi)的很多信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等過(guò)程。筆者猜測(cè)在視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期，一側(cè)眼視覺(jué)刺激的減少，使TRPV3表達(dá)受抑制，可能使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生改變，從而影響視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖等，最終可能引發(fā)弱視的發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，TRPV3可能參與調(diào)節(jié)其發(fā)育、分化生長(zhǎng)或凋亡。當(dāng)視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)長(zhǎng)期形覺(jué)剝奪使剝奪眼所支配的視覺(jué)系統(tǒng)神經(jīng)元在與對(duì)側(cè)眼占據(jù)突觸位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)時(shí),視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞TRPV3蛋白的表達(dá)降低，可能導(dǎo)致了Ca2+在節(jié)細(xì)胞的運(yùn)輸障礙，從而影響視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和功能發(fā)揮，可能是弱視發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。至于TRPV3蛋白在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞發(fā)育的不同階段的表達(dá)變化及其在弱視發(fā)生中的詳細(xì)機(jī)制還有待深入研究。本研究結(jié)果表明，視覺(jué)發(fā)育關(guān)鍵期內(nèi)單眼形覺(jué)剝奪性弱視動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞TRPV3蛋白表達(dá)降低,提示TRPV3蛋白可能是弱視發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一。