張 可，陳 靜，周 燕

（1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/呼吸疾病實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541000；2.泰安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，山東 泰安 271000）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種發(fā)病率日益增高的睡眠呼吸疾病，其病理生理學(xué)特點(diǎn)為間歇性低氧，與高血壓密切相關(guān)[1]。血管重構(gòu)與高血壓密切相關(guān)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)[2]，阻斷其發(fā)生發(fā)展是治療高血壓的重要途徑，越來(lái)越受到臨床的關(guān)注[3]。研究表明[4]，氧化應(yīng)激會(huì)激活JNK 信號(hào)通路，是體內(nèi)高血壓進(jìn)展的重要病理生理途徑，介導(dǎo)著血管重構(gòu)的發(fā)生。本研究通過(guò)觀察間歇性低氧能否調(diào)控JNK信號(hào)通路引起高血壓，并探討其可能作用機(jī)制，旨在為治療OSA 合并高血壓提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)-廣西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雄性8 周齡SD 大鼠共36 只，體重160～200 g，隨機(jī)均分為四組：常氧對(duì)照組、常氧干預(yù)組、間歇性低氧組、間歇性低氧干預(yù)組，各9 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 低壓氧艙；動(dòng)脈血壓測(cè)量?jī)x；光學(xué)顯微鏡；基因擴(kuò)增儀：TC020A-230V；穩(wěn)壓電泳儀：DYY-6D型；蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)：TE22型；數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)：JS-780型；數(shù)字圖像分析系統(tǒng)：IPP-5.0 形態(tài)學(xué)分析軟件；Trizol RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；JNK 阻滯劑：SP600125[5]；JNK-1 山羊抗小鼠多克隆抗體；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 將造模組大鼠放置于低氧艙內(nèi)，每日固定時(shí)間循環(huán)充入氮?dú)夂脱鯕? h，具體方法為首先充入氮?dú)?0 s，在30 s 內(nèi)將氧濃度下降至4%～6%，保持該氧濃度1 min 使大鼠處于缺氧狀態(tài)，然后充入氧氣10 s，使氧濃度恢復(fù)至21%，保持20 s，持續(xù)2 min。常氧對(duì)照組及常氧對(duì)照干預(yù)組大鼠將充入氣體更改為空氣，進(jìn)行相同處理，該處理持續(xù)12 周；常氧干預(yù)組及間歇性低氧干預(yù)組大鼠每天以30 mg/kg 的SP600125 進(jìn)行灌胃，對(duì)剩余兩組大鼠行生理鹽水灌胃。

1.3.2 血壓測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周固定時(shí)間進(jìn)行對(duì)鼠尾平均動(dòng)脈血壓（MAP）進(jìn)行測(cè)定，測(cè)量3 次血壓后取3 次血壓的平均值。

1.3.3 病理學(xué)檢測(cè) 不同組別大鼠處死后分離腹主動(dòng)脈，固定標(biāo)本后進(jìn)行染色，觀察腹主動(dòng)脈病理學(xué)改變，并測(cè)量各組腹主動(dòng)脈中膜厚度（MT）、管腔直徑（LD）、兩者比值以及中膜膠原纖維面積百分比。

1.3.4 Western blot 法檢測(cè)JNK-1 蛋白在大鼠腹主動(dòng)脈組織中的表達(dá) 稱(chēng)取各組大鼠腹主動(dòng)脈10 mg 左右，經(jīng)研磨-裂解-震蕩-離心后吸取上清液測(cè)定蛋白濃度，最后通過(guò)Western blot 檢測(cè)腹主動(dòng)脈中JNK-1 蛋白水平。

1.3.5 RT-PCR 法檢測(cè)JNK-1mRNA 在大鼠腹主動(dòng)脈組織中的表達(dá) 取各組大鼠腹主動(dòng)脈組織稱(chēng)重，選取等重量組織在低溫條件下研磨至粉末狀，按說(shuō)明依次進(jìn)行RNA 提取-測(cè)定RNA 純度及完整度-RNA 逆轉(zhuǎn)錄-RT-PCR 進(jìn)行JNK-1mRNA 目的基因片段擴(kuò)增-RT-PCR 產(chǎn)物電泳。目的片段的相對(duì)表達(dá)量=JNK-1mRNA 的灰度值/β-actin 的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓變化情況 與同周齡常氧對(duì)照組大鼠比較，自造模2 周后，間歇性低氧組大鼠血壓升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與同周齡間歇低氧組大鼠比較，間歇性低氧干預(yù)組大鼠血壓下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；間歇性低氧干預(yù)組大鼠血壓與同周齡常氧對(duì)照組大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血壓變化情況（，mmHg）

表1 各組大鼠血壓變化情況（，mmHg）

注：與常氧對(duì)照組比較，*P＜0.05；與間歇性低氧組比較，△P＜0.05

2.2 各組大鼠腹主動(dòng)脈病理結(jié)果比較 各組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜MT、LD、MT/LD 及中膜膠原纖維面積百分比變化情況見(jiàn)表2。與間歇性低氧組比較，間歇性低氧干預(yù)組大鼠腹主動(dòng)脈無(wú)明顯內(nèi)膜破壞，動(dòng)脈中膜血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）數(shù)量下降（P＜0.05），腹主動(dòng)脈未見(jiàn)中層彈性膜明顯增加，層次排列較整齊，壁層厚度較統(tǒng)一，層次較分明，未見(jiàn)平滑肌纖維破裂；與同培養(yǎng)時(shí)間常氧干預(yù)組大鼠比較，間歇性低氧干預(yù)組大鼠腹主動(dòng)脈中膜血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）層數(shù)無(wú)明顯增加或減少（P＞0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腹主動(dòng)脈病理結(jié)果比較

表2 各組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜各指標(biāo)變化情況（）

表2 各組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)膜各指標(biāo)變化情況（）

注：與常氧對(duì)照組比較，*P＜0.05；與間歇性低氧組比較，△P＜0.05

2.3 各組大鼠腹主動(dòng)脈JNK-1mRNA RT-PCR 表達(dá)比較 四組均于138 bp 處出現(xiàn)JNK-1mRNA 表達(dá)條帶，其中間歇性低氧組表達(dá)量高于常氧對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在兩間歇性低氧組中，間歇性低氧干預(yù)組JNK-1mRNA 表達(dá)量低于間歇性低氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與常氧干預(yù)組比較，間歇性低氧干預(yù)組JNK-1mRNA 表達(dá)量增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腹主動(dòng)脈JNK-1mRNA RT-PCR 表達(dá)比較

2.4 各組大鼠胰腹主動(dòng)脈JNK-1 蛋白Westernblot結(jié)果比較 與常氧對(duì)照組比較，間歇性低氧組JNK-1 蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與常氧對(duì)照組比較，間歇性低氧干預(yù)組JNK-1 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與常氧干預(yù)組比較，間歇低氧干預(yù)組JNK-1 蛋白表達(dá)水平增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠胰腹主動(dòng)脈JNK-1 蛋白WesternBlot 結(jié)果比較

3 討論

OSA 是一種發(fā)病率日益增長(zhǎng)的呼吸睡眠疾病，目前我國(guó)OSA 患者已達(dá)6600 萬(wàn)[6]。OSA 患者在睡眠時(shí)反復(fù)出現(xiàn)上氣道完全或部分堵塞，進(jìn)而出現(xiàn)間歇性低氧表現(xiàn)，是高血壓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7]。研究表明[8]，OSA 主要通過(guò)激活交感神經(jīng)系統(tǒng)、激活RASS系統(tǒng)、增加氧化應(yīng)激、損傷內(nèi)皮及全身炎癥反應(yīng)等方式導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。另有研究表明[9，10]，高血壓的主要病理特點(diǎn)為血管內(nèi)皮功能障礙，血管收縮增加和血管重構(gòu)，而VSMCs 表型轉(zhuǎn)化與血管重構(gòu)密切相關(guān)，其主要通過(guò)免疫及炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。由此推測(cè)，OSA 可能通過(guò)某種信號(hào)通路對(duì)VSMCs 進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響血管重構(gòu)及高血壓的發(fā)生。

c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要家族成員[11]。JNK 蛋白激酶由由三種蛋白激酶基因編碼[12]，其中JNK1-3 通過(guò)磷酸化激活后，不同JNK 異構(gòu)體通過(guò)特定模式與特定的蛋白底物激活、結(jié)合及進(jìn)行磷酸化[13]。JNK 分別由JNK 激酶1、2 激活，并從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而與細(xì)胞核內(nèi)的ATF2 和c-Jun 尾端的63、73 位絲氨酸結(jié)合，引導(dǎo)相關(guān)基因與蛋白的表達(dá)，廣泛參與體內(nèi)的炎癥及免疫反應(yīng)[14]。

目前研究JNK 信號(hào)及OSA 相互關(guān)系的實(shí)驗(yàn)不多，已有資料顯示在大腦海馬區(qū)的損傷中二者關(guān)系密切。相關(guān)研究表明[15]，大鼠在間歇性缺氧環(huán)境下海馬區(qū)的JNK 磷酸化水平上升，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生影響。丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是氧化應(yīng)激的主要標(biāo)志物[16]。間歇性低氧使機(jī)體MDA 表達(dá)水平上升及SOD 表達(dá)水平下降，同時(shí)導(dǎo)致JNK 表達(dá)水平上升，證實(shí)間歇性低氧會(huì)引導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn)，進(jìn)而上調(diào)JNK 基因及相關(guān)蛋白表達(dá)，對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)造成損害并破壞記憶功能[17]。另外，隨著間歇性低氧持續(xù)時(shí)間增加，大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)亦隨之增強(qiáng)，體內(nèi)組織的相關(guān)JNK 基因及蛋白表達(dá)水平隨之上升，由此推斷JNK信號(hào)通路參與了OSA 患者炎癥反應(yīng)，并與炎癥反應(yīng)的發(fā)展密切相關(guān)。

當(dāng)前有關(guān)JNK 信號(hào)通路作用于血管重構(gòu)的研究較少。已有研究表明，血管重構(gòu)與VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，VSMCs 作為動(dòng)脈中膜的主要細(xì)胞成分，可以根據(jù)生理形態(tài)及功能的不同，分為收縮型和合成型[18]。當(dāng)受到免疫炎癥反應(yīng)刺激后，VSMCs 發(fā)生轉(zhuǎn)化，其表達(dá)形式發(fā)生轉(zhuǎn)變，由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，進(jìn)而介導(dǎo)VSMCs 增殖和轉(zhuǎn)移，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成增加，最終導(dǎo)致血管重構(gòu)，這也是高血壓的重要病理特征之一[19，20]。因此，JNK 信號(hào)通路作為的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路，其可能參與了腹主動(dòng)脈中VSMCs 的表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而介導(dǎo)血管重構(gòu)的產(chǎn)生。

本研究結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組大鼠比較，間歇性低氧組大鼠MAP 升高，而間歇性低氧干預(yù)組大鼠MAP 較間歇性低氧組大鼠下降，且與常氧干預(yù)組MAP 水平比較無(wú)差異，說(shuō)明JNK 信號(hào)通路調(diào)控OSA 高血壓的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧組大鼠腹主動(dòng)脈出現(xiàn)血管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、彈性纖維損害、平滑肌細(xì)胞丟失及內(nèi)膜厚度增加等血管重構(gòu)現(xiàn)象，而間歇性低氧干預(yù)組中腹主動(dòng)脈血管重構(gòu)現(xiàn)象不明顯，說(shuō)明JNK 信號(hào)通路參與OSA 合并高血壓大鼠的腹主動(dòng)脈血管重構(gòu)過(guò)程。另外，Western blot及RT-PCR 結(jié)果顯示，間歇性低氧組大鼠腹主動(dòng)脈組織中JNK mRNA 及JNK 相關(guān)蛋白的表達(dá)水平較常氧對(duì)照組增高，但與間歇性低氧干預(yù)組大鼠對(duì)比，JNK mRNA 及JNK 相關(guān)蛋白的表達(dá)水平下降，這進(jìn)一步提示JNK 信號(hào)通路參與了OSA 合并高血壓大鼠的血管重構(gòu)現(xiàn)象，結(jié)合間歇性低氧組大鼠的血管重構(gòu)現(xiàn)象，進(jìn)一步說(shuō)明了JNK 信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)JNK mRNA 及JNK 相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，影響腹主動(dòng)脈血管重構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控OSA 合并高血壓大鼠的血管重構(gòu)情況。因此，抑制JNK 信號(hào)通路可以抑制腹主動(dòng)脈血管重構(gòu)，進(jìn)而抑制高血壓的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，間歇性低氧會(huì)激活JNK 信號(hào)通路，上調(diào)JNK 信號(hào)通路的mRNA 及蛋白表達(dá)水平，引起高血壓，并介導(dǎo)大鼠腹主動(dòng)脈出現(xiàn)的血管重構(gòu)。阻斷JNK 信號(hào)通路能抑制OSA 所致的血壓升高及血管重構(gòu)現(xiàn)象，這可能成為治療阻塞性睡眠呼吸暫停合并高血壓的新思路。