李大偉，劉 磊

食管癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，根據(jù)病理類型可分為食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺狀細(xì)胞癌，約90%的食管癌患者為食管鱗狀細(xì)胞癌[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床在食管癌的診斷和治療方面取得了顯著進(jìn)步，但食管癌患者預(yù)后仍不令人滿意，食管癌發(fā)病機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明[2]。微小RNA(miRNA)是一類小核苷酸非編碼RNA短鏈，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡和遷移等生命活動(dòng)，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展[3]。劉莎莎等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-625在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌基因作用，可能為食管鱗狀細(xì)胞癌潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后判斷標(biāo)志物。高遷移率族蛋白A1(HMGA1)是miR-625的靶基因，ZHOU等[5]研究表明，miR-625可靶向HMGA1抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。然而，miR-625靶向HMGA1對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制現(xiàn)尚不清楚。因此，本研究探討miR-625靶向HMGA1對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制，以期為食管癌早期臨床診斷及靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織和細(xì)胞來源：收集2018年3月—2019年3月經(jīng)手術(shù)切除的食管癌組織及癌旁組織(距癌組織≥5 cm)標(biāo)本各35例，其中男21例，女14例；年齡(63.75±12.36)歲；TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期21例，Ⅲ期10例?；颊咝g(shù)前均未接受放化療和其他治療，無其他重大疾病史。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意執(zhí)行。食管癌細(xì)胞系KYSE150、KYSE30、ECA109、EC9706和正常食管上皮細(xì)胞HET-1A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco)，CCK-8試劑(上海碧云天生物)，脂質(zhì)體2000試劑盒、Trizol試劑、pcDNA3.1載體(美國(guó)Invitrogen)，SYBR Premix Ex Taq kit(北京寶日醫(yī)生物)，ECL試劑盒(武漢博士德生物)，Cyclin D1(ab16663)、p21(ab188224)、E-cadherin(ab40772)、N-cadherin(ab98952)和Vimentin(ab137321)抗體(美國(guó)Abcam)，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Promega)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：以含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，添加胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用脂質(zhì)體2000試劑盒，待細(xì)胞密度達(dá)60%時(shí)，將細(xì)胞分為mimic NC組、miR-625 mimic組、inhibitor NC組、miR-625 inhibitor組及pcDNA3.1-HMGA1組、miR-625+HMGA1組，分別進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，其中mimic NC組加入miR-625 mimic NC質(zhì)粒，miR-625 mimic組加入miR-625 mimic質(zhì)粒，inhibitor NC組加入miR-625 mimic NC質(zhì)粒，miR-625 inhibitor組加入miR-625 inhibitor質(zhì)粒，pcDNA3.1-HMGA1組加入pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒，miR-625+HMGA1組共轉(zhuǎn)染miR-625 mimic質(zhì)粒與pcDNA3.1-HMGA1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染過程均嚴(yán)格按照脂質(zhì)體2000試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)miR-625和HMGA1 mRNA表達(dá)：取適量組織和細(xì)胞，添加Trizol試劑提取總RNA，分析其純度、濃度和完整性，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板鏈，再添加SYBR Premix Ex Taq kit進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃10 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后以72 ℃延伸10 min。miR-625、U6、HMGA1和GADPH引物序列由南京金斯瑞公司提供，以2-ΔΔCt法檢測(cè)目的基因表達(dá)水平。引物序列miR-625上游：5'-GGCTAGTTCACTCCTCTCCTCC-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCAGGT-3'；U6上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；HMGA1上游：5'-TCCATTCTTCGACATCCGTCA-3'，下游：5'-GATCGTGGGCAGAACAGGAG-3'；GADPH上游：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，下游：5'-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3'。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖：以每孔5000個(gè)將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，添加含有10%CCK-8試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，于490 nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞的OD值。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：收集培養(yǎng)好的細(xì)胞重懸于PBS緩沖液中，加入RNA酶，室溫下孵育15 min，加入PI染液，室溫下避光孵育30 min，過濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲：預(yù)先將基質(zhì)膠鋪于Transwell小室上室，將5×104個(gè)細(xì)胞接種于上室，下室中添加含20%胎牛血清培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h后，用棉簽拭去上膜表面細(xì)胞，置于甲醇中固定，結(jié)晶紫染色后，光鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移：將1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)100%時(shí)，用1 ml槍頭垂直孔底于培養(yǎng)孔中軸劃線，沖洗脫落細(xì)胞，于0和24 h時(shí)，光鏡下觀察并拍攝細(xì)胞劃痕愈合情況。

1.2.7Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：將培養(yǎng)好的細(xì)胞加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上層蛋白液檢測(cè)濃度，配制10% SDS-PAGE凝膠，每孔加等量蛋白樣完全分離后，取出蛋白膠濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別孵育封閉液(含5%脫脂奶粉)、一抗(1∶1000)和二抗(1∶5000)，采用ECL試劑盒行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證靶向關(guān)系：經(jīng)生物信息學(xué)軟件Target Scan在線預(yù)測(cè)miR-625靶基因，構(gòu)建含有HMGA1基因野生型(WT)3' 端非編碼區(qū)(3' UTR)和突變型(MUT)3' UTR片段，并插入質(zhì)粒載體。分別將miR-625 mimic、mimic-NC、HMGA1 3' UTR WT和HMGA1 3' UTR MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h后更換為含10%胎牛血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，檢測(cè)各孔熒光素酶活性(相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值)。

2 結(jié)果

2.1不同組織及細(xì)胞中miR-625表達(dá) miR-625相對(duì)表達(dá)量，食管癌組織低于癌旁組織，食管癌細(xì)胞系KYSE150、KYSE30、ECA109、EC9706低于正常食管上皮細(xì)胞HET-1A；miR-625 mimic組較mimic NC組升高，miR-625 inhibitor組較inhibitor NC組降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 食管癌組織及細(xì)胞中miR-625表達(dá)1a.不同食管組織中miR-625的表達(dá)，1b.不同食管細(xì)胞中miR-625的表達(dá)，1c.轉(zhuǎn)染miR-625 mimic和miR-625 inhibitor對(duì)ECA109細(xì)胞中miR-625表達(dá)的影響；與HET-1A和mimic NC組比較，aP<0.05；與inhibitor NC組比較，bP<0.05

2.2miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞增殖和周期影響 與mimic NC組比較，miR-625 mimic組細(xì)胞增殖能力、處于S期細(xì)胞比例和Cyclin D1表達(dá)降低，處于G1期細(xì)胞比例和p21表達(dá)升高(P<0.05)。與inhibitor NC組比較，miR-625 inhibitor組細(xì)胞增殖能力、處于G2期細(xì)胞比例和Cyclin D1表達(dá)升高，處于G1期細(xì)胞比例和p21表達(dá)降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞增殖和周期影響2a.miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞增殖的影響，2b.miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞周期的影響，2c.miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；與mimic NC組比較，aP<0.05；與inhibitor NC組比較，bP<0.05

2.3miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞侵襲和遷移影響 與mimic NC組比較，miR-625 mimic組細(xì)胞侵襲、遷移能力和N-cadherin、Vimentin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高(P<0.05)。與inhibitor NC組比較，miR-625 inhibitor組細(xì)胞侵襲、遷移能力和N-cadherin、Vimentin表達(dá)升高，E-cadherin表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞侵襲和遷移影響3a.miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞侵襲的影響,3b.miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞遷移的影響,3c.miR-625表達(dá)對(duì)ECA109細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響;與mimic NC組比較，aP<0.05；與inhibitor NC組比較，bP<0.05

2.4miR-625與HMGA1靶向關(guān)系 miR-625與HMGA1 3' UTR存在結(jié)合位點(diǎn),見圖4。與mimic NC組比較，miR-625 mimic組細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.05),見圖5。與mimic NC組比較，miR-625 mimic組HMGA1表達(dá)降低，pcDNA3.1-HMGA1組HMGA1表達(dá)升高；與pcDNA3.1-HMGA1組比較，miR-625+HMGA1組HMGA1表達(dá)降低(P<0.05)，見圖6。

圖4 miR-625與HMGA1 3' UTR結(jié)合位點(diǎn)HMGA1為高遷移率族蛋白A1,3' UTR為3' 端非編碼區(qū)

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果與mimic NC組比較，aP<0.05

圖6 miR-625對(duì)細(xì)胞中HMGA1表達(dá)影響HMGA1為高遷移率族蛋白A1;6a.miR-625對(duì)細(xì)胞中HMGA1 mRNA表達(dá)的影響,6b.miR-625對(duì)細(xì)胞中HMGA1 蛋白表達(dá)的影響;與mimic NC組比較，aP<0.05；與pcDNA3.1-HMGA1組比較，bP<0.05

2.5miR-625靶向HMGA1對(duì)ECA109細(xì)胞影響 與mimic NC組比較，miR-625 mimic組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力及處于S期細(xì)胞比例降低，處于G1期細(xì)胞比例增加；pcDNA3.1-HMGA1組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力及處于G2期細(xì)胞比例升高，處于G1期細(xì)胞比例降低(P<0.05)。與pcDNA3.1-HMGA1組比較，miR-625+HMGA1組細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力降低，處于G1期細(xì)胞比例升高(P<0.05)。見圖7。

圖7 miR-625靶向HMGA1對(duì)ECA109細(xì)胞影響HMGA1為高遷移率族蛋白A1;7a.miR-625靶向HMGA1對(duì)ECA109細(xì)胞增殖的影響,7b.miR-625靶向HMGA1對(duì)ECA109細(xì)胞周期的影響,7c.miR-625靶向HMGA1對(duì)ECA109細(xì)胞侵襲的影響,7d.miR-625靶向HMGA1對(duì)ECA109細(xì)胞遷移的影響;與mimic NC組比較，aP<0.05；與pcDNA3.1-HMGA1組比較，bP<0.05

3 討論

大量研究報(bào)道，多種miRNA在食管癌中呈異常表達(dá)，這種異常表達(dá)可能調(diào)控細(xì)胞多種病理生理學(xué)行為，參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展[6]。ZHANG等[7]分析食管癌臨床樣本，發(fā)現(xiàn)miR-145在食管癌中表達(dá)上調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-145促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和遷移，可能與靶向調(diào)控SMAD5表達(dá)有關(guān)。LANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-486作為腫瘤抑制因子，可靶向調(diào)控CDK4/BCAS2抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。miR-625在食管癌中也發(fā)揮抑癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，miR-625相對(duì)表達(dá)量，食管癌組織低于癌旁組織，食管癌細(xì)胞系KYSE150、KYSE30、ECA109、EC9706低于正常食管上皮細(xì)胞HET-1A。WANG等[9]收集158例食管癌組織樣本，檢測(cè)顯示miR-625在食管癌組織中表達(dá)低于正常組織，分析原因可能為靶向抑制Sox2表達(dá)，減弱食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲。然而，miR-625是否可靶向其他基因作用于食管癌，仍有待深入分析。

惡性增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀、Transwell小室實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期、侵襲和遷移，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-625可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞周期阻滯，抑制其增殖、侵襲與遷移，而抑制miR-625表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述作用。Cyclin D1是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而加速細(xì)胞增殖[10]。p21則是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，可抑制多種細(xì)胞周期蛋白和激酶的活性，限制細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化[11]。本研究轉(zhuǎn)染miR-625 mimic后，細(xì)胞中Cyclin D1表達(dá)下調(diào)，p21表達(dá)上調(diào)，提示miR-625通過調(diào)節(jié)Cyclin D1和p21表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制食管癌細(xì)胞增殖。腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)過程的相互作用，如上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和新生血管形成等[12]。E-cadherin、N-cadherin和Vimentin分別是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中上皮和間質(zhì)表型的標(biāo)志蛋白，腫瘤細(xì)胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化獲得較高的運(yùn)動(dòng)能力，增強(qiáng)侵襲與遷移[13]。本研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-625表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，抑制細(xì)胞中N-cadherin和Vimentin表達(dá)，提示miR-625可能減少食管癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制其侵襲與遷移。

HMGA1是一種非組蛋白的DNA結(jié)合蛋白，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮致癌基因作用，可通過多種途徑影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[14]。TOYOZUMI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，miR-625與HMGA1 3' UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，且雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，miR-625與HMGA1存在靶向關(guān)系。進(jìn)一步共轉(zhuǎn)染miR-625 mimic和pcDNA3.1-HMGA1觀察miR-625是否可靶向HMGA1作用于食管癌細(xì)胞，結(jié)果顯示pcDNA3.1-HMGA1組細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力及處于G2期細(xì)胞比例高于mimic NC組，處于G1期細(xì)胞比例低于mimic NC組；而miR-625+HMGA1組細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力較pcDNA3.1-HMGA1組降低，處于G1期細(xì)胞比例較pcDNA3.1-HMGA1組升高。提示miR-625可靶向HMGA1調(diào)控食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，miR-625在食管癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，且可負(fù)向調(diào)控HMGA1抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，這為食管癌的發(fā)病機(jī)制研究提供了新思路，可能有助于食管癌的早期診斷和治療。