孫 劍，高 楊，康榮基，黃 毅,陸 林

目前,結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升[1]，且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[2]。結(jié)直腸癌總生存率近10年沒(méi)有明顯升高趨勢(shì)，尤其是晚期結(jié)直腸癌患者[3]?，F(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的研究及治療方式的探討仍是熱點(diǎn)內(nèi)容[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在多種惡性腫瘤中具有調(diào)控作用，或許可作為惡性腫瘤預(yù)測(cè)、早期診斷及預(yù)后分析的標(biāo)志物，或者將來(lái)可作為惡性腫瘤治療的靶基因。長(zhǎng)鏈非編碼RNA00261(LINC00261)是一種lncRNA，在多種惡性腫瘤中作為抑癌基因?qū)δ[瘤生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控。LINC00261在胰腺癌、肝癌、肺癌和乳腺癌中介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等，并與腫瘤的惡性臨床病理特征具有相關(guān)性[5-6]，但以往其在結(jié)直腸癌中的研究并不深入。本研究首先采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)LINC00261在結(jié)直腸癌中的研究結(jié)果進(jìn)行了萃取，預(yù)測(cè)了其下游靶標(biāo)miRNA，并在組織和細(xì)胞水平進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，以期為深入研究LINC00261在結(jié)直腸癌中的作用及機(jī)制提供前期研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月—2020年5月遼陽(yáng)市中心醫(yī)院收治的行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌30例，男17例，女13例；年齡41～82(68.9±17.2)歲。30例均手術(shù)切除結(jié)直腸癌組織和距離癌組織邊緣5 cm的正常結(jié)直腸組織標(biāo)本各0.5 cm3置于液氮罐中保存。30例臨床和病理資料均通過(guò)查閱病歷進(jìn)行收集，包括性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、血管神經(jīng)浸潤(rùn)、TNM分期及分化程度。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析：應(yīng)用Linked Omics (http://www.linkedomics.org)進(jìn)行癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)采集分析，對(duì)LINC00261在結(jié)直腸癌組織和正常組織水平的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，并篩選與其相關(guān)聯(lián)的miRNA。采用靶基因預(yù)測(cè)分析軟件對(duì)LINC00261和miR-31的靶向調(diào)控進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：SW480、HCT116、HT-29及FHC細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海典型細(xì)胞庫(kù))采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法，在錦州醫(yī)科大學(xué)科學(xué)試驗(yàn)中心進(jìn)行培養(yǎng)及傳代，采用90% MEM培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司)，10%胎牛血清。培養(yǎng)條件：37 ℃，5%二氧化碳。細(xì)胞培養(yǎng)隔天換液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每組細(xì)胞至少經(jīng)3次傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR:采用qRT-PCR檢測(cè)組織及細(xì)胞中LINC00261和miR-31表達(dá)。所用試劑盒包括Trizol試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自日本TaKaRa公司)。取組織標(biāo)本(結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸組織)3 mm3，在冰上剪碎，并研磨，采用Trizol試劑盒進(jìn)行裂解和總RNA提取。對(duì)于細(xì)胞標(biāo)本(SW480、HCT116、HT-29及FHC細(xì)胞)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行裂解及總RNA提取，采用紫外吸收法檢測(cè)RNA質(zhì)量，包括RNA液濃度、純度和完整性。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系如下：5 μl DEPC水、0.2 μl逆轉(zhuǎn)錄Buffer、0.5 μl逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV、0.2 μl下游引物、0.2 μl上游引物、0.1 μl dNTP、2 μl RNA模板。管家基因?yàn)镚APDH，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)。制備DNA模板用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)體系包括3 μl dNTP混合液、1 μl cDNA、1.5 μl MgCl2溶液、2.5 μl PCR緩沖液、1 μl Taq聚合酶、0.5 μl上游引物F、0.5 μl下游引物R。進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)。將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，繪制溶解曲線。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt。

1.3觀察指標(biāo) 應(yīng)用生物信息學(xué)分析LINC00261在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)及相關(guān)miRNA，采用qRT-PCR檢測(cè)LINC00261和miR-31在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織及細(xì)胞中表達(dá)，分析結(jié)直腸癌組織LINC00261和miR-31表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，探討結(jié)直腸癌組織LINC00261和miR-31表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1生物信息學(xué)分析LINC00261在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中表達(dá)及相關(guān)miRNA 生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，LINC00261在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)低于正常結(jié)直腸組織，見(jiàn)圖1a；結(jié)直腸癌組織中與LINC00261具有負(fù)相關(guān)性的miRNA見(jiàn)圖1b；靶基因預(yù)測(cè)分析軟件預(yù)測(cè)LINC00261與miR-31具有結(jié)合位點(diǎn)，可能具有靶向調(diào)控關(guān)系，見(jiàn)圖1c。

圖1 生物信息學(xué)分析LINC00261在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)及相關(guān)miRNALINC00261為長(zhǎng)鏈非編碼RNA00261；1a.LINC00261在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)；1b.結(jié)直腸癌組織中與LINC00261相關(guān)的miRNA；1c.LINC00261與miR-31相結(jié)合的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)

2.2qRT-PCR檢測(cè)LINC00261和miR-31在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織及細(xì)胞中表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LINC00261在結(jié)直腸癌組織中為1.116±0.586低于正常結(jié)直腸組織2.077±1.153；miR-31在結(jié)直腸癌組織中為2.239±1.145高于正常結(jié)直腸組織1.251±0.759(P<0.05)。LINC00261在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中分別為0.247±0.060、0.443±0.170和0.393±0.248，低于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞1.249±0.286；miR-31在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中分別為1.118±0.172、0.756±0.206和1.535±0.134，高于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞0.331±0.172(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)LINC00261和miR-31在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織及細(xì)胞中的表達(dá)LINC00261為長(zhǎng)鏈非編碼RNA00261；2a.LINC00261在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)；2b.miR-31在結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)；2c.LINC00261在結(jié)直腸癌細(xì)胞株和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)，與FHC比較，aP<0.05；2d.miR-31在結(jié)直腸癌細(xì)胞株和正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)，與FHC比較，aP<0.05

2.3結(jié)直腸癌組織中LINC00261和miR-31表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中LINC00261表達(dá)腫瘤直徑>5 cm、血管神經(jīng)浸潤(rùn)陽(yáng)性、TNM分期Ⅲ或Ⅳ期和低分化程度結(jié)直腸癌患者低于腫瘤直徑≤5 cm、血管神經(jīng)浸潤(rùn)陰性、TNM分期Ⅰ或Ⅱ期和高中分化程度結(jié)直腸癌患者(P<0.05或P<0.01)。結(jié)直腸癌組織中miR-31表達(dá)腫瘤直徑>5 cm和TNM分期Ⅲ或Ⅳ期結(jié)直腸癌患者高于腫瘤直徑≤5 cm和TNM分期Ⅰ或Ⅱ期結(jié)直腸癌患者(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌組織中LINC00261和miR-31表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征相關(guān)性

2.4結(jié)直腸癌組織LINC00261和miR-31表達(dá)相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織LINC00261和miR-31表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.715，P<0.001，95%CI:-0.855，-0.478)，見(jiàn)圖3。

圖3 結(jié)直腸癌組織LINC00261和miR-31表達(dá)Pearson相關(guān)性分析LINC00261為長(zhǎng)鏈非編碼RNA00261

3 討論

非編碼RNA調(diào)控大部分人類基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有明顯調(diào)控作用[7]。lncRNA長(zhǎng)度長(zhǎng)于200個(gè)核苷酸，具有一定蛋白編碼能力[8]。LINC00261在胰腺癌、前列腺癌及肺癌等組織中表達(dá)水平低于對(duì)應(yīng)正常組織，并與藥物治療效果具有較強(qiáng)相關(guān)性[9]。以往文獻(xiàn)有關(guān)結(jié)直腸癌組織LINC00261表達(dá)的研究極少。有研究報(bào)道，在不同腫瘤中，與LINC00261具有靶向調(diào)控關(guān)系的miRNA包括miR-324、miR-769、miR-124、miR-216b、miR-133a及miR-4735等[10]，但在結(jié)直腸癌中現(xiàn)尚缺乏該類研究數(shù)據(jù)。

本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)組織水平LINC00261的研究結(jié)果進(jìn)行了萃取，結(jié)果顯示LINC00261在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)低于正常結(jié)直腸組織；進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)分析收集了與LINC00261具有負(fù)相關(guān)性的miRNA，并通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)分析軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00261與miR-31具有結(jié)合位點(diǎn)，可能具有靶向調(diào)控關(guān)系。由于以往此類通過(guò)生物信息學(xué)分析的數(shù)據(jù)均來(lái)源于西方國(guó)家，樣本量也較小，故本研究以結(jié)直腸癌手術(shù)切除的病理標(biāo)本對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。本研究qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LINC00261在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)低于正常結(jié)直腸組織，miR-31在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)高于正常結(jié)直腸組織；LINC00261在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中表達(dá)低于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞，miR-31在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中表達(dá)高于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞。表明LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致；miR-31在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能作為促癌基因發(fā)揮作用。miRNA作為非編碼RNA在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要生物學(xué)調(diào)控功能。有研究顯示，lncRNA以海綿方式作用于miRNA[11-12]。本研究預(yù)測(cè)LINC00261與miR-31具有結(jié)合位點(diǎn)，但其調(diào)控關(guān)系需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中LINC00261表達(dá)腫瘤直徑>5 cm、血管神經(jīng)浸潤(rùn)陽(yáng)性、TNM分期Ⅲ或Ⅳ期和低分化程度結(jié)直腸癌患者低于腫瘤直徑≤5 cm、血管神經(jīng)浸潤(rùn)陰性、TNM分期Ⅰ或Ⅱ期和高中分化程度結(jié)直腸癌患者；miR-31表達(dá)腫瘤直徑>5 cm和TNM分期Ⅲ或Ⅳ期結(jié)直腸癌患者高于腫瘤直徑≤5 cm和TNM分期Ⅰ或Ⅱ期結(jié)直腸癌患者。表明LINC00261和miR-31與結(jié)直腸癌患者腫瘤直徑和TNM分期等臨床病理特征具有相關(guān)性。有研究顯示，LINC00261在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，其低表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征具有相關(guān)性[13]。LINC00261在肺癌組織中也表現(xiàn)出同樣的抑癌基因特征[12]。本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。本研究通過(guò)Pearson相關(guān)性分析對(duì)結(jié)直腸癌組織LINC00261和miR-31表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織LINC00261和miR-31表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。因此，今后可行進(jìn)一步研究對(duì)LINC00261與miR-31可能存在的靶向調(diào)控關(guān)系進(jìn)行探討。

總之，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)LINC00261在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平進(jìn)行了觀察，并進(jìn)一步驗(yàn)證了LINC00261在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平，預(yù)測(cè)了其與miR-31的調(diào)控靶點(diǎn)，為進(jìn)一步論證LINC00261通過(guò)miR-31調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用及機(jī)制提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為L(zhǎng)INC00261作為結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物、預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)和未來(lái)治療靶點(diǎn)的研究提供了新的靶標(biāo)基因。