章建瀛 王清水 鐘雯婷 林幼玉

【摘要】基因組編輯技術(shù)是幫助治療方法最具挑戰(zhàn)性但最有效的工具之一。Crispr可以提高基因編輯的效率，并盡量減少脫靶率。定期排列的短回文重復(fù)序列（CRISPR）相關(guān)蛋白（Cas9）是一種革命性的基因組編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9在多種疾病中的新應(yīng)用已經(jīng)證明了它的有效性，并已應(yīng)用于體外體細(xì)胞和多能干細(xì)胞的模型，以及體內(nèi)動(dòng)物模型，最終可能被用來(lái)糾正有缺陷的基因。本綜述的重點(diǎn)是CRISPR/Cas9的最近應(yīng)用及其對(duì)治療具有挑戰(zhàn)性的人類(lèi)疾病的貢獻(xiàn)，例如各種類(lèi)型的癌癥、神經(jīng)退行性疾病和廣泛的其他疾病。CRISPR技術(shù)是一種新的疾病治療方法，提高了藥物的有效性，促進(jìn)了個(gè)性化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】CRISPR，Cas9，基因編輯，基因治療，人類(lèi)疾病

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2026-5328（2021）08-104-03

English abstract：Genome editing techniques are considered to be one of the most challenging yet efficient tools for assisting therapeutic approaches. Several studies have focused on the development of novel methods to improve the efficiency of gene editing，as well as minimise their off-target effects.The focus of the present review was the recent applications of CRISPR/Cas9 and its contribution to the treatment of challenging human diseases，such as various types of cancer，neurodegenerative diseases and a broad spectrum of other disorders. CRISPR technology is a novel method for disease treatment，enhancing the effectiveness of drugs and improving the development of personalised medicine.

Keywords：CRISPR，cas9，gene editing，gene therapy，human diseases

細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，形成的一種獲得性免疫防御體系，即CRISPR/Cas9，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。crRNA與 tracrRNA可以通過(guò)堿基配對(duì)形成復(fù)合體，這種復(fù)合體可以介導(dǎo)核酸內(nèi)切酶酶 Cas9蛋白在特定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，而人為去設(shè)計(jì)這兩種RNA可以介導(dǎo)對(duì) DNA 雙鏈進(jìn)行定點(diǎn)切割、DNA 序列的敲除、插入、定點(diǎn)突變以及組合編輯[1]。

II型CRISPR-Cas系統(tǒng)相比于I型和III型，結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，執(zhí)行生物功能的部分僅由Cas9和tracrRNA：crRNA兩個(gè)部分組成，而且操作更加簡(jiǎn)便。之前的研究曾將tracrRNA和crRNA分別表達(dá)形成雙引導(dǎo)RNA系統(tǒng)，但這種系統(tǒng)容易引起非同源重組介導(dǎo)插入缺失的錯(cuò)誤修復(fù)，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)將crRNA與tracrRNA編輯合成單一的RNA嵌合體，也可以指導(dǎo)Cas進(jìn)行切割[2]。通過(guò)基因工程手段對(duì)crRNA和tracrRNA進(jìn)行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合后的RNA具有與crRNA：tracrRNA復(fù)合體類(lèi)似的活力，但因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)得到了簡(jiǎn)化更方便研究者使用。通過(guò)將表達(dá)sgRNA的原件與表達(dá)Cas9的原件相連接，得到可以同時(shí)表達(dá)兩者的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞，便能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行操作。

質(zhì)粒等載體通過(guò)tracrRNA：crRNA介導(dǎo)Cas9切割的位點(diǎn)是有特異性的，即PAM序列上游的三個(gè)堿基對(duì)處。PAM僅有幾個(gè)堿基構(gòu)成（通常為NGG），它可以根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的類(lèi)型定位并精確排序[2]。PAM 序列是Cas9識(shí)別靶DNA的重要影響因素。目前研究表明，II型CRISPR特異性靶位點(diǎn)必須完美結(jié)合PAM序列和在gRNA3’末端的seed sequence 8-12個(gè)堿基[1]。

由于編輯基因效率高、設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)單與在多種細(xì)胞中通用性好等優(yōu)勢(shì)，CRISPR-Cas9 的基因組編輯技術(shù)成為ZFNs 與TALENs 之后的新一代基因組編輯技術(shù)。為了測(cè)CRISPR-Cas9系統(tǒng)HR（同源重組）的效率，研究者設(shè)計(jì)兩種gRNA（T1和T2）作用于AAVS1片段，并且與之前了解到的TALEN技術(shù)進(jìn)行活性比較。圖中，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)明顯可以看出donor+ hCas9+T1 gRNA組、donor+hCas9+T2gRNA組比donor+AAV51 TALENs組的同源重組率要高得多[1]。ZFNs技術(shù)和TALENs都是之前已知已應(yīng)用于基因組編輯人工核酸內(nèi)切酶的方法，這兩種方法只能在DNA的單鏈形成缺口，有一定的技術(shù)局限，而且成本較高，而CRISPR/Cas9酶可以在可以在DNA雙鏈上形成缺口，操作比較簡(jiǎn)單并且效果顯著。

CRISPR的II型系統(tǒng)內(nèi)，為了識(shí)別并在目標(biāo)DNA上形成雙鏈切口，有幾個(gè)結(jié)構(gòu)是很重要的，一是crRNA與tracrRNA這兩種RNA組成的dual-RNA結(jié)構(gòu)或類(lèi)似結(jié)構(gòu)（sgRNA），二是Cas9內(nèi)切酶，三是特定的位點(diǎn)即PAM序列。編輯好的Cas9內(nèi)切酶與設(shè)計(jì)成一個(gè)單一轉(zhuǎn)錄因子的gRNA相互配合，可以標(biāo)記并切割DNA序列。CRISPR-Cas9為基因靶標(biāo)和基因編輯應(yīng)用提供了更多可能性[2]。

CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用

一、在人類(lèi)細(xì)胞基因水平上CRISPR-Cas9基因敲出、篩選。

通過(guò)編輯CRISPR關(guān)聯(lián)的內(nèi)切酶Cas9去修改特定的基因底座是一種新方法，這種方法可以更簡(jiǎn)單地了解基因的在全基因組水平上的功能。基因水平上CRISPR-Cas9 基因敲除庫(kù)已經(jīng)標(biāo)記了18080個(gè)基因和64751個(gè)獨(dú)特的引導(dǎo)序列可以用于在人類(lèi)細(xì)胞中的陰性篩選和陽(yáng)性篩選。首先，在癌細(xì)胞和多能干細(xì)胞中使用GeCKO（genome-scale CRISPR-Cas9 knockout）庫(kù)識(shí)別細(xì)胞存活必要基因，接著，在黑色素瘤模型中篩選缺失vemurafenib抑制劑的基因。研究者研究得到的最好的候選基因有NF1、MED12、NF2、CUL3、TADA2B和 TADA1。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，不同的gRNA靶向相同的基因有很高的命中率，確定Cas9基因篩選前景的光明[4]。

GeCKO篩選是一個(gè)系統(tǒng)而獨(dú)特的方法，用RNA抑制劑干擾基因的功能。RNA抑制劑會(huì)減少目標(biāo)RNA蛋白的表達(dá)量，而GeCKO可以引導(dǎo)功能缺失的突變體進(jìn)入DNA。RNA抑制劑可以限制轉(zhuǎn)錄，而Cas9：sgRNAs可以識(shí)別基因組內(nèi)的很多因子，比如啟動(dòng)子：增強(qiáng)子、內(nèi)含子和基因間隔區(qū)。此外，催化Cas9不活躍的突變體可以根據(jù)不同功能域被分類(lèi)，進(jìn)而擴(kuò)大其干擾方式，包括基因組功能篩選的應(yīng)用、Cas9的激活和表觀遺傳修飾。運(yùn)用不同sgRNA有效進(jìn)行完全基因敲除有著高度一致性，因此通過(guò)Cas9：sgRNA技術(shù)改變基因組的功能是可行的[4]。

二、用CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯多種基因

選擇性干擾個(gè)別基因原件造成的基因突變需要精準(zhǔn)有效地基因識(shí)別技術(shù)，雖然之前已經(jīng)有ZFs、TALEs等技術(shù)可以以DNA為靶標(biāo)，但是不夠有廣泛性而且成本較高。因此研究者設(shè)計(jì)了新的基因編輯工具，這個(gè)工具是基于II型原核生物的CRISPR獲得性免疫系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶制作而來(lái)的。II型原核CRISPR的獲得性免疫系統(tǒng)已被證明能促進(jìn)RNA指導(dǎo)的特殊位點(diǎn)DNA切割。研究者設(shè)計(jì)了兩種不同的II型CRISPR系統(tǒng)，并且證明了可以用短序列RNA指導(dǎo)Cas9核酸精準(zhǔn)切割在人類(lèi)以及小鼠細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源基因座。Cas9也可以修飾成切口酶，用最小的致突變活性促進(jìn)同源定向修復(fù)[5]。

研究者在哺乳動(dòng)物細(xì)胞編碼SpCas9和RNaseIII并附上核苷酸定位因子以便區(qū)分。這些結(jié)構(gòu)在人類(lèi)的293FT細(xì)胞中表達(dá)，說(shuō)明兩種核酸定位因子識(shí)別SpCas9很有效果。通過(guò)重組、熒光表達(dá)、電泳、測(cè)序等步驟后發(fā)現(xiàn)，RNase III 在protospacer（原型間隔序列）的切割過(guò)程中是不需要的，并且當(dāng)RNase III 不存在的時(shí)候，89-nt tracrRNA可以被加工。同樣pre-crRNA的成熟也不需要RNase III，這證明可能有內(nèi)源性RNases可以幫助crRNA前體成熟。去除任何剩余的RNA或Cas9原件會(huì)使CRISPR系統(tǒng)的基因組切割活性丟失。因此這些結(jié)果證明CRISPR有效介導(dǎo)基因修飾需要三個(gè)原件系統(tǒng)。接著研究者以EMX1基因座的原始間隔序列為靶標(biāo)，探究真核細(xì)胞中CRISPR介導(dǎo)的切割效果是否具有普遍性，證明他們?cè)O(shè)計(jì)的驅(qū)動(dòng)pre-crRNA和SpCas9表達(dá)載體可行性[5]。

S. Pyogenes CRISPR系統(tǒng)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的異源重組進(jìn)行方便高效的基因組編輯，并證實(shí)CRISPR介導(dǎo)的基因靶標(biāo)多種人類(lèi)細(xì)胞是十分高效的。在S. Pyogenes CRISPR系統(tǒng)NGG序列的需求限制了靶標(biāo)間隔（8bp），但探索Cas9家族和不同PAM的需求可以打破這些限制。事實(shí)上，其他CRISPR位點(diǎn)很可能被移植到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，比如嗜熱鏈球菌 LMD-9 CRISPR1也可以介導(dǎo)哺乳動(dòng)物基因組切割[5]。

三、CRISPR/Cas系統(tǒng)與HIV

通過(guò)高效的抗逆轉(zhuǎn)病毒可以控制HIV-1病毒的復(fù)制，這時(shí)候HIV-1病毒處于休眠狀態(tài)，稱(chēng)之為潛在的前病毒，但它可能在任何時(shí)候?qū)θ梭w再次構(gòu)成威脅。但是，以擾亂HIV-1病毒前體為目標(biāo)的新技術(shù)可能從染上病毒的個(gè)體根除病毒基因組。LTR-targeting CRISPR/Cas9組件轉(zhuǎn)染HIV病毒休眠表達(dá)處或者已經(jīng)誘導(dǎo)的T 細(xì)胞中，刺激后LTR引起有意缺失表達(dá)，從而導(dǎo)致HIV無(wú)法致病。通過(guò)序列分析證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效切割靶位點(diǎn)，并引起LTR靶位點(diǎn)突變。研究者成功擾亂HIV-1病毒前體的表達(dá)，Cas9蛋白有著RuvC和HNH兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，擁有自主的ssDNA切割活性，而突變體缺失RuvC和HNH其中一部分就會(huì)變成內(nèi)切酶。為了抑制HIV-1 前病毒表達(dá)，TAR位點(diǎn)是最理想的靶基因。CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶標(biāo)專(zhuān)一性很強(qiáng)，靶基因的1 個(gè)堿基發(fā)生突變都有可能導(dǎo)致干擾識(shí)別，這意味著一些病毒前體可能從這個(gè)基因編輯結(jié)構(gòu)中逃脫。而TAR位點(diǎn)相對(duì)比較保守，而且在不同的HIV 病毒亞類(lèi)中也基本一致。通過(guò)研究，作者等人發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯HIV-1基因組可以抑制其表達(dá)的潛能性[6]。

四、通過(guò)CRISPR/Cas介導(dǎo)的基因編輯一步設(shè)計(jì)帶有報(bào)道因子的小鼠

研究者通過(guò)共注射Cas9 mRNA、不同的sgRNA和不同大小的DNA載體進(jìn)入小鼠受精卵，構(gòu)建突變小鼠。通過(guò)one-step技術(shù)構(gòu)建出在Nanog，Sox2、Oct4、Mecp2等基因上有熒光信號(hào)因子的突變小鼠模型。另外，用sgRNA靶標(biāo)兩個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)在Mecp2基因上，使小鼠約700bp堿基缺失。從而在改造基因的小鼠和胚胎干細(xì)胞中分析5種sgRNA脫靶的可能性，并在罕見(jiàn)的例子中識(shí)別出脫靶突變體。采用CRISPR/Cas類(lèi)型II 系統(tǒng)成功生產(chǎn)出了含有5 個(gè)基因突變的小鼠[7]。

在這項(xiàng)研究中，證明了CRISPR/Cas技術(shù)可以有效應(yīng)用one-step在精確的基因底座上插入稍短的抗原決定部位或者是稍長(zhǎng)的熒光標(biāo)記，使的小鼠內(nèi)生基因上帶有報(bào)告因子更加容易。在有些細(xì)胞中脫靶突變體的比例較多，有些細(xì)胞中則較少?？傊?，CRISPR / CAS介導(dǎo)的基因組編輯是一種簡(jiǎn)單而有效的方法去構(gòu)建小鼠復(fù)雜的基因突變體，比如one-step在小鼠基因上插入內(nèi)生報(bào)道因子。這種方法可以應(yīng)用在其他哺乳動(dòng)物上，開(kāi)放了更多復(fù)雜基因編輯的可能性在替他物種之間，但胚胎干細(xì)胞（ES cells）不起作用[7]。

五、運(yùn)用CRISPR/Cas9構(gòu)建骨髓惡性腫瘤小鼠模型

人類(lèi)惡性腫瘤通常在4個(gè)或更多的驅(qū)動(dòng)基因上都有突變點(diǎn)，用一些傳統(tǒng)的方法解釋這些基因的復(fù)雜程度是很困難的，因此可以采用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)去克服這些困難。通過(guò)構(gòu)建與sgRNAs和Cas9結(jié)合的慢性病毒載體，在老鼠單個(gè)造血干細(xì)胞上改造了多達(dá)5個(gè)基因，構(gòu)建出患有骨髓惡性腫瘤的模型。通過(guò)在這個(gè)載體上的一系列實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明通過(guò)sgRNA：Cas9慢性病毒載體基因編輯，可以更好反應(yīng)人類(lèi)疾病的復(fù)雜程度[8]。

展望

ZFNs，TALENs技術(shù)已被廣泛地用于基因組定點(diǎn)修飾。但是目前為止，無(wú)論是ZFNs 還是TALENs 的篩選以及組裝過(guò)程都存在著較高的技術(shù)難度，并且效率較低[9]。CRISPR / CAS系統(tǒng)是一種新的可對(duì)基因組進(jìn)行靶向修飾的系統(tǒng)，Cas 蛋白可以在gRNA 的引導(dǎo)下對(duì)外來(lái)入侵的DNA 進(jìn)行定點(diǎn)切割，CRISPR / CAS系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)易的高效基因定點(diǎn)修飾技術(shù)提供了嶄新的平臺(tái)。但是這個(gè)系統(tǒng)還存在著一些局限，例如CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)靶基因的識(shí)別依賴(lài)于PAM元件，這就限制了其對(duì)靶基因的選擇，而且存在著脫靶效應(yīng)。但隨著進(jìn)一步研究這些瓶頸將會(huì)被克服?？偠灾珻RISPR / CAS，會(huì)發(fā)展成為一種操作方便、特異性強(qiáng)、切割效率高、并能應(yīng)用于各種生物的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)。

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