陳明偉+范彬彬+盧華定

[摘要] 目的 探討新型透明質(zhì)酸改性的聚乙烯亞胺-殼聚糖/DNA（CS-g-PEI/pDNA）納米粒作為治療骨關(guān)節(jié)炎（OA）的可行性。 方法 通過復(fù)凝聚法制備成CP/pDNA納米粒，然后通過巰基的原位交聯(lián)與巰基化的透明質(zhì)酸（HA-SH）形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，從而合成HA-CP/pDNA納米粒；透射電鏡觀察納米粒形貌，馬爾文粒度分析儀分析其不同構(gòu)成比（HA-SH∶CP）時的粒徑、表面電位等；凝膠電泳阻滯實驗檢測CP/pDNA的結(jié)合力；CCK-8細胞毒性實驗檢測該基因載體的細胞毒性；以HA-CP/pDNA納米粒、裸pDNA、CS/pDNA、CP/pDNA納米粒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染軟骨細胞，熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測基因轉(zhuǎn)染效率。 結(jié)果 ①HA-CP/pDNA納米粒呈較均一的球形，并隨HA-SH∶CP質(zhì)量比的增加，粒徑先減小后增大，表面電位電荷逐漸降低。②HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞毒性遠低于LipofectamineTM2000（P < 0.05）。③HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞轉(zhuǎn)染率較CP/pDNA、CS/pDNA納米粒大大提高（P < 0.05）。④大量游離HA導(dǎo)致HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞的轉(zhuǎn)染效率下降。 結(jié)論 HA-CP/pDNA納米粒具有更強的DNA保護能力，對軟骨細胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高，并且對軟骨細胞具有一定的靶向性。

[關(guān)鍵詞] 透明質(zhì)酸；CP/pDNA納米粒；基因治療；軟骨細胞

[中圖分類號] R318.08 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（c）-0004-06

[Abstract] Objective To investigate the feasibility of hyaluronic acid modified CS-g-PEI/pDNA nanoparticles and mediated gene transfection against osteoarthritis. Methods CP was engaged with pEGFP into nanopartricles by using complex coaceration method and then covering the CP/pDNA with HA-SH， HA-SH forming disulfide cross-linked gene complex， and on the surface of the CP/pDNA form cross-linked network with HA， synthesis HA-CP/pDNA； the morphy of nanoparticle was obtained by TEM， the particle size and surface potential were measured by Malvern particle size analyzer； The pDNA binding ability with CP and the influence of HA-SH on CP were evaluated by gel retardation assay； the cytotoxicity of HA-CP/pDNA nanoparticles was evaluated by CCK-8 assays； HA-CP/pDNA nanoparticles， nake pDNA， CS/pDNA， CP/pDNA nanoparticles and lipofectamineTM2000 transfected chondrocytes， the transfection efficiency was measured by flurescence microscope， flow cytometry. Results ①TEM showed that the nanoparticles were well-formed spherical shapes with compact structure， and increased with HA-SH∶CP weight ratio increasing， nanoparticle sizes decreased firstly then increased， the surface potentials gradually decrease. ②The cytotoxicity of HA-CP/pDNA nanoparticles had lower cellular toxicity than LipofectamineTM2000 （P < 0.05）. ③The HA-CP/pDNA nanoparticles transfection efficiency for chondrocytes was highly improved compared to CS/pDNA， CP/pDNA nanoparticles （P < 0.05）. ④Free HA decrease HA-CP/pDNA nanoparticles transfection efficiency notably. Conclusion HA-CP/pDNA has lower cytotoxicity and higher transfection efficiency， and it has the ability of targeting chondrocytes.

[Key words] Hyaluronic acid； CS-g-PEI/pDNA； Gene therapy； Chondrocyte

在基因治療中，理想的基因載體應(yīng)具有較高的轉(zhuǎn)染率、良好的靶向性等安全性特點[1]。病毒載體靶向特異性差，存在高免疫原性、致癌性等缺陷[2-3]。而非病毒基因載體因其低免疫性、較高靶向性及材料可修飾性，成為當(dāng)下研究熱點[4-6]。聚乙烯亞胺-殼聚糖/DNA（CS-g-PEI/pDNA）納米粒能有效保護質(zhì)粒DNA免受核酸酶降解，對關(guān)節(jié)軟骨細胞有較高的轉(zhuǎn)染效率[7]；HA因其高度的黏彈性、可塑性、優(yōu)良的生物相容性等特點，被廣泛應(yīng)用于臨床包括骨關(guān)節(jié)炎（OA）的治療。本研究創(chuàng)新性地將巰基化的透明質(zhì)酸（HA-SH）與CS-g-PEI/pDNA納米粒相結(jié)合形成透明質(zhì)酸改性的CS-g-PEI/pDNA（HA-CP/pDNA）納米粒。通過理化特征檢測及體外基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞實驗等，探討其作為治療骨關(guān)節(jié)炎靶向基因載體的可行性，為開發(fā)出安全高效的治療OA的新型靶向基因治療藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭3周齡白兔3只，體重0.5～0.6 kg，均為雄性，購置于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心（合格證號：SCXK 2008-0002）。

1.2 主要試劑及儀器

殼聚糖（CS，50 kD，脫乙酰度85%～90%）、聚乙烯亞胺（PEI，1.8 kD）、Ⅱ型膠原酶（Sigma-Aldrich，美國）；pEGFP、DH5α感受態(tài)細胞、LipofectamineTM2000、CCK-8（Invetrigen，美國）；高糖DMEM、PBS、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/EDTA（Gibco，美國）；青霉素G鈉、兩性霉素B（廣州杰特偉公司，中國）；HA（10 kD，山東正大福瑞達生化有限公司，中國）；去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（Omega）；流式細胞儀（BD FACSCalibu）；磁共振儀（ARX400，Bruker，德國）；馬爾文ZS90粒度儀（馬爾文儀器公司，英國）；倒置熒光顯微鏡（Nikon-TE2000-U，日本）。

1.3 方法

1.3.1 pDNA準備 將pEGFP經(jīng)E.coli DH5α細胞在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進行增殖。利用Omega質(zhì)粒大提試劑盒進行質(zhì)粒的提取、純化。所得質(zhì)粒pEGFP經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測純度與濃度，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HA-CP/pDNA納米粒的制備 參照Jiang等[8]和Pezzoli等[9]的方法進行CP的合成，HA-SH的合成參考Jin等[10]和He等[11]的方法。合成后的樣品溶于D2O/CD3COOD（11∶1），通過1HNMR檢測，得到核磁譜圖，核磁軟件MestReNova進行分析。

將1 μg/μL CP按一定質(zhì)量比與pDNA輕柔混合，靜電吸附[12]作用制得CP/pDNA納米粒溶液。將1 μg/μL HA-SH水溶液滴至CP/pDNA（pH = 5.5）中，納米粒表面形成HA涂層，介質(zhì)pH調(diào)至7.4，通過氧氣中巰基的原位交聯(lián)形成基因復(fù)合物組裝體，即制得HA-CP/pDNA納米粒。

1.3.3 HA-CP/pDNA納米粒形貌特征檢測及表面電荷測定 無水乙醇分散HA-CP/pDNA納米粒溶液，滴于銅網(wǎng)放置30 min，真空干燥過夜，磷鎢酸負染后透射電鏡觀察。馬爾文ZS90粒度儀測量HA-CP/pDNA納米粒粒徑及表面Zeta電位。

1.3.4 凝膠電泳阻滯實驗 取裸pDNA溶液和不同質(zhì)量比的CP/pDNA納米粒溶液（CP∶pDNA為1∶20、1∶8、1∶6、1∶4、1∶2、1∶1），進行1%瓊脂糖凝膠電泳。配制不同質(zhì)量比的HA-SH：CP/pDNA（1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1）溶液并將其加入到CP/pDNA中觀察HA-SH與CP/pDNA的濃縮能力，電泳并分析結(jié)果。

1.3.5 HA-CP/pDNA納米粒的細胞毒性試驗 細胞毒性試驗采用CCK-8法進行測定[21]，計算細胞存活率。計算公式=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%，計算結(jié)果后對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.6體外轉(zhuǎn)染軟骨細胞 重新制備CS/pDNA、CP/pDNA（CP：pDNA質(zhì)量比為5∶1）、HA-SH/pDNA的納米粒溶液，裸pDNA為陰性對照組，LipofectamineTM2000為陽性對照組。取第3代軟骨細胞以1×105/孔接種到24孔板中，每孔預(yù)先加入500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)基；PBS輕洗2遍，加入500 μL無FBS、雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min后除去培養(yǎng)基；將不同納米粒溶液、裸pDNA以2 μg/孔pDNA加入500 μL不含F(xiàn)BS、雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染則以每孔0.6 μg pDNA∶1.8 μL LipofectamineTM2000加入培養(yǎng)孔中。培養(yǎng)4 h后，更換完全培養(yǎng)基（500 μL/孔）培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%的胰蛋白酶/EDTA消化3 min，1000 r/min 5 min，PBS重懸，流式細胞儀定量檢測綠色熒光蛋白表達率。在轉(zhuǎn)染HA-CP/pDNA納米粒之前，細胞培養(yǎng)孔中加入過量HA，分別為HA-CP/pDNA納米粒中HA-SH的10、20、40倍，流式細胞儀定量檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CP和HA-SH的核磁檢驗

圖1所示，CS在化學(xué)位移δ = 3.0×10-6～4.1×10-6，PEI在化學(xué)位移δ = 2.1×10-6～3.5×10-6為其特征質(zhì)子峰。圖1a表明，CS和PEI成功進行了接枝反應(yīng)，通過核磁計算接枝率為5.5%，圖2表明1HNMR圖譜中化學(xué)位移δ = 1.9×10-6處的信號峰為HA乙酰氨基甲基上的氫原子，化學(xué)位移δ = 2.5×10-6～2.7×10-6處為HA-SH中半胱胺亞甲基上的質(zhì)子峰，表明HA巰基化成功[10，13]。采用Ellman試劑法[14]測定HA-SH中巰基的接枝率約為4.2%。

2.2 HA-CP/pDNA納米粒形態(tài)特征及表面電荷

圖3所示，HA-SH∶CP質(zhì)量比為10∶1時經(jīng)透射電鏡下觀察，HA-CP/pDNA納米粒形態(tài)表面光滑的球形，粒徑在100～300 nm之間，分散度良好。納米粒的粒徑隨HA-SH∶CP質(zhì)量比增加先減小后增大，Zeta電位逐漸減?。▓D4）。HA-SH∶CP質(zhì)量比為5∶1時，粒徑最小為（255.7±11.4）nm。HA-SH∶CP質(zhì)量比大于5∶1后，電位越小，納米粒經(jīng)越大，甚至在質(zhì)量比為20∶1時，納米粒徑達到700 nm以上。

2.3 凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果

由圖5a可知，裸pDNA跑出加樣孔，而CP/pDNA納米粒隨著CP與pDNA質(zhì)量比的增高后，跑出的條帶越來越弱，在CP∶pDNA為1∶2時，能阻滯pDNA向陽極移動，使pDNA條帶消失。加入HA-SH后（CP∶pDNA為1∶4），圖5b可觀察到隨著加入HA-SH量的增加，原有跑出的pDNA條帶逐漸消失。

2.4 細胞毒性實驗

HA-CP/pDNA納米粒與CP/pDNA納米粒對軟骨細胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。在針對軟骨細胞的細胞毒性實驗中，實驗組的HA-CP/pDNA納米粒和的CP/pDNA納米粒濃度增至40 μg/mL時細胞的存活率也在90%以上，顯著高于對照組（5 μg/mL的LipofectamineTM2000），差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。HA-CP/pDNA納米粒，軟骨對細胞毒性均顯著低于LipofectamineTM2000（P < 0.01），后者的細胞存活率低于60%。見圖6。

2.5 體外基因轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果

2.5.1 不同載體體外轉(zhuǎn)染軟骨細胞和滑膜細胞的比較 HA-CP/pDNA納米粒組與LipofectamineTM2000組熒光強度最強，CP/pDNA和CS/pDNA納米粒組有較多細胞表達綠色熒光蛋白，裸pDNA組只有極個別細胞表達弱的綠色熒光，四組之間軟骨細胞的轉(zhuǎn)染效率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖7。流式細胞儀檢測HA-CP/pDNA、CP/pDNA、CS/pDNA、裸pDNA和LipofectamineTM2000組48 h轉(zhuǎn)染率分別為（26.46±1.76）%，（16.34±1.26）%，（6.78±0.62）%，（0.32±0.06）%和（28.26±2.07）%（n = 6，P < 0.05）（圖8，封三）。HA-CP/pDNA納米粒組與裸pDNA、CP/pDNA納米粒組、CS/pDNA納米粒組在轉(zhuǎn)染率差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而與LipofectamineTM2000組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.5.2 HA對HA-CP/pDNA轉(zhuǎn)染軟骨細胞效率的影響 隨著轉(zhuǎn)染前加入HA量的增加，HA-CP/pDNA對軟骨細胞的轉(zhuǎn)染效率逐漸降低，當(dāng)50倍于HA-CP/pDNA中HA-SH的量時，轉(zhuǎn)染效率降低顯著（P < 0.05）。見圖9。

3 討論

基因治療中理想的基因載體應(yīng)具有生物相容性好、毒性低、轉(zhuǎn)染效率高等特點[15-16]。軟骨細胞表面存在的CD44膜蛋白受體是最常見的透明質(zhì)酸受體[17-18]。本實驗通過HA與CD44受體特異性結(jié)合，實現(xiàn)靶向基因轉(zhuǎn)染，提高CP對軟骨細胞的轉(zhuǎn)染效率。本實驗將巰基化的HA通過氧氣中巰基的原位交聯(lián)[11]，在CP/DNA表面形成帶HA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，可促使聚合物更穩(wěn)定，通過HA-CD44作用達到對軟骨細胞的靶向基因轉(zhuǎn)染。核磁結(jié)果證明了CP與HA-SH的合成是成功的。隨著HA-SH∶CP質(zhì)量比的增加納米粒的粒徑先減小后增大，Zeta電位逐漸減小。粒徑先減小后增大主要是因為，在一定范圍內(nèi)HA-SH∶CP質(zhì)量比≤10∶1時，加入的HA-SH通過氧氣中巰基的原位交聯(lián)，在CP/pDNA納米粒表面形成HA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，對納米粒進一步壓縮，使得聚合物更加穩(wěn)定，粒徑更?。涣皆龃笫怯捎陔S著HA-SH加入量的增加，過量的HA-SH使得納米粒表面電荷越來越小；當(dāng)HA-SH∶CP質(zhì)量比≥20∶1時，納米粒的Zeta電位趨于中性，而納米粒在溶液中維持形態(tài)首先要聚合物結(jié)合緊密，其次需要足夠的同性電荷斥力來保持納米粒之間的距離，當(dāng)電荷逐漸減小時，納米粒表面電荷之間靜電作用力越來越弱，使得納米粒溶液極不穩(wěn)定，納米粒相互聚集[19]。

在凝膠阻滯實驗中，隨著CP∶pDNA質(zhì)量比的提高，凝膠電泳跑出的pDNA的條帶越來越弱，說明CP：pDNA聚合物結(jié)合pDNA的能力越來強，而游離出來的pDNA也越來越少。當(dāng)質(zhì)量比為1∶2時，已無明顯的條帶跑出，說明此時聚合物完全包裹pDNA。在CP/pDNA（1：4）的復(fù)合物中加入HA-SH可看到，隨著HA-SH的增加，原有跑出的條帶逐漸減弱，當(dāng)HA-SH∶CP/pDNA質(zhì)量比為10∶1時，已無條帶跑出，這也證實了HA-SH對CP/pDNA納米粒具有進一步壓縮作用，使納米粒更加穩(wěn)定。CCK-8細胞毒性實驗檢測顯示，即使HA-CP/pDNA納米粒濃度達到至40 μg/mL，細胞的存活率也能達到90%以上，其細胞毒性遠小于LipofectamineTM2000?？赡芤驗镠A具有良好的生物相容性，且合成的CP中引入的是小分子的PEI（1.8 kD），所帶表面電荷較低，CP細胞毒性較小。因此HA-CP/pDNA納米粒可作為一種安全的基因載體應(yīng)用于OA的基因治療。

由體外基因轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果可知，HA-CP/pDNA納米粒轉(zhuǎn)染效率明顯高于CP/pDNA、CS/pDNA，主要因為：①納米粒載體進入細胞方式的多樣化。在HA-SH對CP/pDNA進行修飾后，形成的納米粒一方面通過HA與軟骨細胞表面的CD44受體特異性結(jié)合，利用受體介導(dǎo)的細胞內(nèi)吞方式進入細胞；另一方面，在HA-SH∶CP質(zhì)量比為10∶1時，納米粒表面仍帶有正電荷，可與胞膜上有帶負電荷的脂肪酸結(jié)合，使得納米粒沉積于細胞表面從而被內(nèi)吞進入細胞。②HA與CD44的相互作用引發(fā)細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)促進轉(zhuǎn)染效率的提高[20]。③HA與CP/pDNA的結(jié)合方式使得HA-CP/pDNA納米粒具有較高穩(wěn)定性。HA-CP/pDNA納米粒進入細胞后，在GSH作用下，二硫鍵還原成SH，納米粒表面交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)破壞，HA-CP/pDNA解離，釋放DNA，細胞分裂時，DNA有更多的機會進入細胞核表達目的基因。④HA可作為一種基因轉(zhuǎn)錄活化劑[21]，提高HA-CP/pDNA納米粒的基因轉(zhuǎn)染效率。在轉(zhuǎn)染之前加入過量的HA，HA-CP/pDNA的轉(zhuǎn)染效率明顯降低[22]，這是因為游離的HA與軟骨細胞表面的受體CD44結(jié)合[15，23]，競爭性的抑制了HA-CP/pDNA中HA與CD44的結(jié)合，進一步說明了HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞的靶向作用。轉(zhuǎn)染早期HA-CP/pDNA的轉(zhuǎn)染效率低下，而細胞轉(zhuǎn)染48 h后，轉(zhuǎn)染效率明顯升高，這是因為HA-CP/pDNA納米粒經(jīng)細胞膜內(nèi)吞作用進入細胞后，需要在GSH的作用下首先降解HA-SH在CP/pDNA表面形成的二硫鍵網(wǎng)絡(luò)后才能逐漸釋放出所攜帶的DNA，因其緩控釋性能，大大增強了其在體內(nèi)關(guān)節(jié)疾病中的應(yīng)用潛能。

實驗通過復(fù)凝聚法構(gòu)建了CP/pDNA納米粒，再在其表面覆蓋HA-SH，通過氧氣中巰基的原位交聯(lián)形成基因復(fù)合物組裝體，制得HA-CP/pDNA納米粒，并對其理化性質(zhì)及對pDNA的保護能力進行檢測；HA-CP/pDNA納米粒與軟骨細胞相容性良好，在有效的轉(zhuǎn)染濃度范圍內(nèi)，CCK-8試驗表明其毒性遠遠低于LipofectamineTM2000，安全性可靠。HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞的轉(zhuǎn)染率較CS/pDNA、CP/pDNA高，與LipofectamineTM2000相當(dāng)。HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞具有一定的靶向性，隨著配體HA的引入，能大幅提高CP、CS載體對關(guān)節(jié)軟骨細胞的轉(zhuǎn)染效率，同時減少毒副作用，因此HA-CP/pDNA納米?？勺鳛橹委烵A等關(guān)節(jié)疾病的一種非病毒基因載體。本實驗雖然證實了HA-CP/pDNA納米粒具有一定的靶向性并可提高軟骨細胞體外基因轉(zhuǎn)染的效率。但此研究尚停留在細胞分子水平，對于HA-CP/pDNA納米粒在體內(nèi)的體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效果及有無不良反應(yīng)，尚待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Akita H，Ishiba R，Hatakeyama H，et al. A Neutral envelope-type nanoparticle containing pH-Responsive and SS-Cleavable lipid-like material as a carrier for plasmid DNA [J]. Advanced Healthcare Materials，2013，2（8）：1120-1125.

[2] Tiera MJ，Shi Q，Winnik FM，et al. Polycation-based gene therapy：current knowledge and new perspectives [J]. Curr Gene Ther，2011，11（4）：288-306.

[3] Tripathi SK，Goyal R，Kumar P，et al. Linear polyethylenimine-graft-chitosan copolymers as efficient DNA/siRNA delivery vectors in vitro and in vivo [J]. Nanomedicine，2012，8（3）：337-345.

[4] Mao S，Sun W，Kissel T. Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA [J]. Adv Drug Deliv Rev，2010，62（1）：12-27.

[5] Steinert AF，Noth U，Tuan RS. Concepts in gene therapy for cartilage repair [J]. Injury，2008，39（Supp 11）：S97-S113.

[6] Yue Y，Jin F，Deng R，et al. Revisit complexation between DNA and polyethylenimine effect of uncomplexed chains free in the solution mixture on gene transfection [J]. J Control Release，2011，155（1）：67-76.

[7] 盧華定，戴馭虎，連禮熠，等.聚乙烯亞胺-殼聚糖/DNA納米粒的制備及介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染關(guān)節(jié)軟骨細胞[J].中國組織工程研究，2013，17（47）：8162-8168.

[8] Jiang HL，Kim YK，Arote R，et al. Chitosan-graft-polyethylenimine as a gene carrier [J]. J Control Release，2007，117（2）：273-280.

[9] Pezzoli D，Olimpieri F，Malloggi C，et al. Chitosan-graft-branched polyethylenimine copolymers：influence of degree of grafting on transfection behavior [J]. PLoS One，2012，7（4）：e34711.

[10] Jin R，LS，Teixeira M，et al. Synthesis and characterization of hyaluronic acid-poly （ethylene glycol） hydrogels via Michael addition：An injectable biomaterial for cartilage repair [J]. Acta Biomaterialia，2010，6：1968-1977.

[11] He YY，Cheng G，Xie L，et al. Polyethyleneimine/DNA polyplexes with reduction-sensitive hyaluronic acid derivatives shielding for targeted gene delivery [J]. Biomaterials，2012， 34（4），1235-1245.

[12] Chen H，Cui S，Zhao Y，et al. Grafting chitosan with poly-ethylenimine in an ionic liquid for efficient gene delivery [J]. PLoS One，2015，10（4）：e0121817.

[13] Yang JA，Kim H，Park K，et al. Molecular design of hyaluronic acid hydrogel networks for long-term controlled delivery of human growth hormone [J]. Soft Matter，2011，7：868-870.

[14] Ellman GL. A colorimetric method for determining low concentrations of mercaptans [J]. Arch Biochem Biophys. 1958，74：443-450.

[15] Zheng F，Shi XW，Yang GF，et al. Chitosan nanoparticle as gene therapy vector via gastrointestinal mucosa administration：results of an in vitro and in vivo study [J]. Life Sci，2007，80（4）：388-396.

[16] 何偉.載藥納米粒制備的研究進展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13（14）：33-36.

[17] Zhao MD，Cheng JL，Yan JJ，et al. Hyaluronic acid reagent functional chitosan-PEI conjugate with AQP2-siRNA suppressed endometriotic lesion formation [J]. Int J Nano-medicine，2016，11：1323.

[18] Keles E，Song Y，Du D，et al. Recent progress in nanomaterials for gene delivery applications [J]. Biomaterials Science，2016，4（9）：1291-1309.

[19] Zhao QQ，Chen JL，Lv TF，et al. N/P ratio significantly influences the transfection efficiency and cytotoxicity of a polyethylenimine/chitosan/DNA complex [J]. Biol Pharm Bull，2009，32（4） ：706-710.

[20] Lai WF，Lin MC. Chemotherapeutic drugs interfere with gene delivery mediated by chitosan-graft-poly （ethylenimine）[J]. PLoS One，2015，10（5）：e0126367.

[21] Zhao MD，Cheng JL，Yan JJ，et al. Hyaluronic acid reagent functional chitosan-PEI conjugate with AQP2-siRNA suppressed endometriotic lesion formation [J]. Int J Nano-medicine，2016，11：1323.

[22] Lu HD，Zhao HQ，Wang K，et al. Novel hyaluronic acid-chitosan nanoparticles as non-viral gene delivery vectors targeting osteoarthritis [J]. Int J Pharm，2011，420：358-365.

[23] Sarett SM，Werfel TA，Chandra I，et al. Hydrophobic interactions between polymeric carrier and palmitic acid-conjugated siRNA improve PEGylated polyplex stability and enhance in vivo pharmacokinetics and tumor gene silencing [J]. Biomaterials，2016，97：122-132.