孫文采

DOI：10.16660/j.cnki.1674-098X.2017.11.244

摘 要：基因組靶向修飾效率低是目前基因治療的難題之一。近年來基因組定點修飾技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，為克服這一難題提供了新的途徑。鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）或規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）技術(shù)可以對DNA進行雙鏈切割，通過細胞的同源重組修復(fù)機制，能夠?qū)崿F(xiàn)對靶基因進行高效的定點修飾。該文主要針對這三種基因修飾工具，分別對其作用原理，在動物細胞基因定點修飾中的應(yīng)用及其局限性進行綜述，以期為構(gòu)建動物疾病模型，治療遺傳疾病提供新思路。

關(guān)鍵詞：基因定點修飾 基因治療 ZFNs TALENs CRISPR/Cas9

中圖分類號：Q78 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-098X（2017）04（b）-0244-02

基因組定點修飾技術(shù)是指利用基因工程的方法對基因組進行靶向改造的技術(shù)?；蚪M定點修飾技術(shù)為畜牧基因的改良、基因功能的研究以及遺傳性疾病治療提供了有力的工具，因此該技術(shù)對于構(gòu)建動物疾病模型，治療遺傳疾病都具有重要的意義。基因組定點修飾技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了一個漫長過程。起初，科學(xué)家們通過同源重組的方法進行基因組修飾，但是自然條件下發(fā)生同源重組的幾率非常低，只有10-6 [1]。為了提高基因組定點修飾的效率，科學(xué)家們建立了Cre/loxP[2]、PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[3]，PhiC31整合酶系統(tǒng)[4]等方法。Cre/loxP可以進行條件性基因敲除或者敲入，目前主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物模型的制備，但是首先要在基因組中插入loxP序列，如何提高loxP插入的效率仍然是一個亟待解決的問題。PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和PhiC31整合酶系統(tǒng)都可以實現(xiàn)外源基因的特異性整合，但是PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)會破壞細胞的內(nèi)源基因，而PhiC31整合酶系統(tǒng)不能進行定點整合。近年來興起的基因修飾技術(shù)如鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）或規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）技術(shù)，克服了先前基因組定點修飾技術(shù)的缺陷，可以對DNA進行雙鏈切割，通過細胞的同源重組修復(fù)機制，能夠?qū)崿F(xiàn)對靶基因進行高度特異和高效的定點修飾，為動物細胞基因組的定點修飾提供了新的途徑。該文就這三種基因修飾方法的作用原理、在動物基因組定點修飾中的應(yīng)用進行綜述，并分別剖析了其應(yīng)用局限性，展望了這三大基因組修飾系統(tǒng)的應(yīng)用前景，以期為構(gòu)建動物疾病模型，治療遺傳疾病提供新思路。

1 鋅指核酸酶（ZFNs）

1.1 ZFNs的作用原理

鋅指核酸酶單體主要包括兩部分：位于C末端的核酸酶結(jié)構(gòu)域FokI和位于N端的特異性識別DNA的鋅指蛋白 （zinc fnger protein， ZFP）。ZFP通常由3～6個鋅指組成折疊形成ββα的二級結(jié)構(gòu)，每個鋅指能夠識別基因組中3bp長的DNA序列，因此單個ZFN可以識別9～18個堿基。當(dāng)兩個鋅指核酸酶單體分別與基因組中的特定序列結(jié)合且兩個鋅指核酸酶單體的分子間距在6～8bp時，F(xiàn)okI會形成二聚體發(fā)揮DNA切割活性。將DNA雙鏈切斷形成雙鏈斷裂切口。細胞會啟動DNA修復(fù)機制，主要包括非同源重組末端連接修復(fù)和DNA同源重組修復(fù)。前者會造成靶位點附近小片段的隨機插入或者缺失引起基因敲除；后者可以實現(xiàn)基因的敲入或者敲除。

1.2 ZFNs在動物細胞基因定點修飾中的應(yīng)用及其局限性

目前，鋅指核酸酶已經(jīng)在人類胚胎干細胞、果蠅、斑馬魚、大鼠、小鼠模式動物中實現(xiàn)了基因組的定點修飾。同時，鋅指核酸酶在遺傳疾病治療中也發(fā)揮了重要作用。2005年，美國的Sangamo公司利用鋅指核酸酶對免疫缺陷相關(guān)基因Il2Rγ進行了定點修復(fù)。Sangamo公司利用鋅指核酸酶實現(xiàn)了CCR5基因的定點修飾，從而提高T淋巴細胞對HIV病毒的抵抗力。2011年，Soldner等利用鋅指核酸酶對α-synuclein的點突變位點進行定點修飾，從而對帕金森疾病進行疾病治療。同年，Yusa利用鋅指核酸酶造成DNA雙鏈斷裂然后利用同源重組的方法將α1-抗胰蛋白酶導(dǎo)入到細胞中在小鼠中實現(xiàn)了α1-抗胰蛋白酶缺陷引起的肝病的基因治療。2014年，Genovese等利用鋅指核酸酶在造血干細胞中插入Il2RG基因的cDNA，在免疫缺陷小鼠中重建造血系統(tǒng)。鋅指核酸酶在基因治療中發(fā)揮了重要作用，但是該技術(shù)本身仍然存在局限性，比如構(gòu)建難，周期長，價格昂貴以及脫靶會導(dǎo)致細胞毒性。這些局限性限制了鋅指核酸酶在基因治療中的廣泛應(yīng)用。

2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）

2.1 TALENs的作用原理

TALENs的構(gòu)造類似于ZFN，主要是由DNA結(jié)合域和分子剪刀“Fok I”組成。不同的是：TALENs的DNA結(jié)合域是一段很長的重復(fù)氨基酸序列，是由1.5～33.5個TALE單元組成。每個TALE單元包括33～35個氨基酸組成，不同的TALE單元之間只有12，13位的氨基酸是不同的，其決定DNA堿基的識別點。目前為止，只有五種TALEN單元，其余DNA的對應(yīng)關(guān)系分別為：氨基酸HD特異識別堿基C、氨基酸NI特異識別堿基A、氨基酸NN特異識別堿基G或A、氨基酸NG特異識別堿基T、氨基酸NK可以識別堿基A、T、C、G中的任一種。因此，TALE單元與DNA堿基之間有更好地對應(yīng)關(guān)系。每個TALEN單體識別的靶序列長度一般在14～20個堿基，因此相比于ZFN，TALENs識別靶點的特異性更強，脫靶率更低。TALENs的工作原理類似于ZFNs，當(dāng)FokI 形成二聚體時切開DNA雙鏈，F(xiàn)okI的切割位點位于兩個TALEN單體識別的靶標(biāo)序列之間，此間隔一般在15～30 bp之間。DNA雙鏈斷裂后，細胞啟動修復(fù)體制，利用同源重組或者非同源重組末端連接修復(fù)進行基因修飾。

2.2 TALENs在動物細胞基因定點修飾中的應(yīng)用及其局限性

目前為止，TALENs不僅在果蠅、蛔蟲、斑馬魚、青蛙、大鼠和豬等模式動物中實現(xiàn)了基因組的定點編輯，而且在斑馬魚和人的基因組中實現(xiàn)了定點插入。2012年，Sun利用TALENs和同源片段對缺陷型β珠蛋白基因進行定點修飾，使其恢復(fù)到正常序列，進而治療鐮刀型紅細胞病。2013年，Wang等利用TALENs對小鼠胚胎干細胞基因組進行修飾，獲得了Sry和Uty的突變的基因修飾小鼠。2014年，Liu等利用TALENs技術(shù)在猴的身上成功實現(xiàn)了Rett綜合征和孤獨癥相關(guān)的基因Mecp2的突變。2014年，Park等利用TALENs技術(shù)在hiPSC中成功將含有F8基因的140 kb染色體片段倒置。2015年，Menger等在特異性識別巨細胞病毒的T細胞中利用TALEN敲除糖皮質(zhì)激素受體的基因，提高了造血干細胞移植的存活率。TALENs技術(shù)相比于ZFNs有一定的優(yōu)勢，但是其本身仍然存在一些問題尚未解決，比如：TALENs重復(fù)序列在什么長度下活性最高，識別特異性最好；TALENs的脫靶率和細胞毒性雖然比ZFNs小但是仍未得到徹底解決。

3 規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas9）

3.1 CRISPR/Cas9的作用原理

CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)主要包括三部分：trans-activating crRNA（tracrRNA）、DNA內(nèi)切酶Cas9蛋白編碼基因和CRISPR RNAs（crRNA）基因座。CRISPR主要由25～50 bp的同向重復(fù)序列（repeat）和26～72 bp的間隔序列（spacer）構(gòu)成，其中重復(fù)序列被間隔序列間隔。CRISPR/Cas9的作用機制為：外源DNA作為短的回文重復(fù)序列整合在CRISPR基因組中，在RNaseIII催化作用下加工成熟，和tracrRNA通過堿基配對結(jié)合形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，共同指導(dǎo)Cas9蛋白在與crRNA引導(dǎo)序列互補的位點進行DNA雙鏈切割，造成雙鏈斷裂。細胞會啟動DNA相應(yīng)的修復(fù)模式。與ZFN和TALEN等相比，CRISPR/Cas9具有打靶效率高、操作簡單、成本低、適用范圍廣的優(yōu)點。

3.2 CRISPR/Cas9在動物細胞基因定點修飾中的應(yīng)用及其局限性

目前，CRISPR/Cas9已經(jīng)在多種細胞和模式動物中實現(xiàn)了基因組修飾。2013年，兩個實驗室同時利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人類細胞中實現(xiàn)了基因組的靶向修飾。隨后，Wang 和Yang等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實現(xiàn)了對多基因的同時修飾，獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。2014年，Xie等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的矯正了誘導(dǎo)多能干細胞基因組中人β血紅蛋白基因的突變，為β地中海貧血病的基因治療提供了一種有效的策略。同年，F(xiàn)eng等利用CRISPR/Cas9定點敲除與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因CDK11，成功抑制骨肉瘤細胞的增殖。2014年，Yin等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠中成功實現(xiàn)了對突變基因FAH的糾正修復(fù)，為遺傳酪氨酸血癥的基因治療提供了有效方法。2015年，Yang等利用CRISPR-Cas9技術(shù)在豬基因組中將包括豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）的病毒在內(nèi)的62個重復(fù)的基因失活，促進了異種器官移植的進一步發(fā)展。CRISPR-Cas9基因組修飾技術(shù)對基因治療的發(fā)展具有重要意義，但是其本身仍然存在一些問題沒有解決。比如：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對真核生物是否存在細胞毒性？CRISPR/Cas9未來如何在整體水平進行應(yīng)用？

4 展望

基因組定點修飾技術(shù)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用均有重大意義。ZFN、TALEN、CRISPR等新興的基因編輯技術(shù)使基因敲除和插入技術(shù)變得更為簡便快捷，這對研究基因功能和實現(xiàn)基因治療非常重要。目前，許多模式動物的單基因疾病模型尚未建立，利用這些新興技術(shù)在模式動物的胚胎干細胞中進行基因敲除或者定點修飾，對于研究該基因的功能和某些疾病的致病機理具有重要意義；另一方面，基因治療是根治遺傳性疾病的最直接的辦法，但是由于同源重組效率低下，基因組修飾技術(shù)不夠完善，阻礙了這一治療方法的廣泛應(yīng)用。近年新興的這三大基因組修飾系統(tǒng)都大大提高了基因編輯的效率，為人類疾病的治療帶來嶄新的機遇。在今后的發(fā)展中，如果能夠針對這些基因編輯工具引起的免疫反應(yīng)和脫靶效應(yīng)建立安全、有效的檢測手段；減弱細胞毒性；優(yōu)化基因?qū)胂到y(tǒng)，一定能夠極大地促進基因治療的廣泛應(yīng)用。雖然這些基因修飾技術(shù)仍然存在許多問題，但是相關(guān)研究的最新進展表明該技術(shù)的應(yīng)用將漸趨成熟，發(fā)展也更全面。利用這些技術(shù)開展的基因治療將會對腫瘤及人類遺傳性疾病的治療帶來重大影響。

參考文獻

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